N6衍生肽的应用制造技术

技术编号:21125656 阅读:78 留言:0更新日期:2019-05-17 23:08
本发明专利技术公开了N6衍生肽的应用,所述N6衍生肽是由序列如SEQ ID NO:1所示的抗菌肽N6的羧基末端经酰胺化得到的。本发明专利技术通过对抗菌肽N6分子结构进行优化设计,得到衍生肽。实验证明衍生肽对革兰氏阴性菌具有很好的杀菌效果。羧基末端的酰胺化衍生肽具有更好的耐酸性、更低的溶血性和细胞毒性,使得衍生肽具有比N6更好的体内治疗小鼠毒血症效果;衍生肽分子量小,人工合成方便,是极具应用价值的小分子多肽,可用于制备新型抗菌抗感染药物,具有良好的应用前景。此外,本发明专利技术为新型抗菌药物的创制提供理论参考依据。

Application of N6 Derived Peptide

The invention discloses the application of N6-derived peptide, which is obtained by amidation of the carboxyl end of the antimicrobial peptide N6 shown in sequence SEQ ID NO:1. The derivative peptide is obtained by optimizing the molecular structure of the antimicrobial peptide N6. Experiments show that the derivative peptide has a good bactericidal effect on Gram-negative bacteria. Carboxyl-terminated amide-derived peptides have better acid resistance, lower hemolysis and cytotoxicity, which make them have better in vivo therapeutic effect than N6 on mice with toxicemia. Derived peptides with small molecular weight and easy synthesis are small molecular polypeptides with great application value, which can be used to prepare new anti-bacterial and anti-infective drugs, and have good application prospects. In addition, the invention provides a theoretical reference basis for the creation of new antimicrobial drugs.

【技术实现步骤摘要】
N6衍生肽的应用
本专利技术涉及生物医药领域,具体地说,涉及一种N6衍生肽(N6NH2)的应用。
技术介绍
抗菌肽是由生物有机体产生的前体经蛋白酶降解生成的具有生物学活性的小分子多肽,主要构成了机体防御的第一道防线。专抗革兰氏阴性菌的抗菌肽对细菌的作用机制主要是以膜作为靶点,通过静电力和受体介导的细胞膜作用力,引起膜通透性改变,降低细胞膜稳定性,或插入细胞膜中形成跨膜孔洞,最终导致细菌内容物外泄而死亡。由于抗菌肽特殊的作用机制,使其不易产生耐药性,并且对许多临床耐药菌同样具有杀菌作用。因此,抗菌肽被认为可以替代传统抗生素,应用于饲料添加剂、医药卫生和食品防腐等领域。抗菌肽N6是海蚯蚓肽NZ17074的衍生物,在体外具有较强的杀灭革兰阴性菌活性,其抗菌活性、细胞毒性有待进一步改善。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种结构稳定性基本不变的情况下体内抗菌效果得以显著提升的N6衍生肽的应用。为了实现本专利技术目的,第一方面,本专利技术提供一种N6衍生肽(N6NH2),由序列如SEQIDNO:1所示的抗菌肽N6的羧基末端(C端)经酰胺化得到的,其结构如下:GFAWNVCVYRNGVRVCHRRAN-NH2。所述N6衍生肽带5个正电荷,1对二硫键(Cys7-Cys16),分子量为2476.8Da,等电点为11.64。第二方面,本专利技术提供所述N6衍生肽在制备治疗细菌感染的抗菌药物或组合物中的应用。本专利技术所述细菌包括革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌。所述革兰氏阴性菌包括但不限于埃希氏菌属(Escherichia)细菌、沙门氏菌属(Salmonella)细菌。进一步地,所述革兰氏阴性菌包括但不限于大肠杆菌(E.coli)、铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)、肠炎沙门氏菌(S.enteritidis)、鼠伤寒沙门氏菌(S.Typhimurium)。例如,E.coliCVCC195。所述革兰氏阳性菌包括但不限于葡萄球菌属(Staphylococcus)细菌。优选金黄色葡萄球菌(S.aureus)、猪葡萄球菌(S.hyicus)。第三方面,本专利技术提供所述N6衍生肽在制备抗毒血症药物或组合物中的应用。第四方面,本专利技术提供由所述N6衍生肽制备的治疗细菌(特别是革兰氏阴性菌)感染的抗菌药物或组合物。第五方面,本专利技术提供由所述N6衍生肽制备的抗毒血症(特别是由革兰氏阴性菌所致毒血症)药物或组合物。本专利技术对N6NH2的抗菌活性、血清稳定性、pH稳定性、溶血性、细胞毒性和体内外药效进行了评价,结果表明N6NH2与母体肽N6的MIC值相同,其血清稳定性与N6相当;N6NH2比N6具有更强的耐酸性、更低的溶血性和细胞毒性;在小鼠毒血症模型的试验中能够显著提高小鼠的存活率,4μmol/kgN6NH2对致死剂量大肠杆菌攻毒小鼠的存活率为100%,明显高于等当量的N6(80%)。借由上述技术方案,本专利技术至少具有下列优点及有益效果:本专利技术通过对抗菌肽N6分子结构进行优化设计,得到衍生肽N6NH2。实验证明N6NH2对革兰氏阴性菌具有很好的杀菌效果。羧基末端的酰胺化使得衍生肽N6NH2的耐酸性(pH=2)比N6提高了3.1%;在浓度为256μg/mL时,N6NH2的溶血性比N6下降了1.5%;在128μg/mL时,N6NH2的细胞毒性比N6下降了6.2%。小鼠毒血症动物试验结果表明4μmol/kgN6NH2比N6的治疗效果提高了20%;N6NH2分子量小,人工合成方便,是极具应用价值的小分子多肽,可用于制备新型抗菌抗感染药物,具有良好的应用前景。此外,本专利技术为新型抗菌药物的创制提供理论参考依据。附图说明图1为本专利技术衍生肽N6NH2的质谱图。图2为本专利技术实施例3中对衍生肽N6NH2的血清稳定性测定结果。图3为本专利技术实施例3中衍生肽N6NH2的pH稳定性测定结果。图4为本专利技术实施例4中衍生肽N6NH2的溶血性测定结果。图5为本专利技术实施例5中衍生肽N6NH2的细胞毒性测定结果。图6为本专利技术实施例6中对毒血症小鼠的保护实验结果。具体实施方式以下实施例用于说明本专利技术,但不用来限制本专利技术的范围。若未特别指明,实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段,所用原料均为市售商品。实施例1N6NH2衍生肽的设计与合成1、以N6母体肽序列为基础,通过对抗菌肽N6的羧基末端酰胺化,增加一个正电荷用以提高抗菌肽的抗菌活性。2、用固相合成法,通过十二通道半自动多肽合成仪进行合成。反向高效液相色谱C18柱测定合成肽纯度(>90%),ESI-MS质谱确认衍生肽N6NH2的分子量(图1)。实施例2衍生肽N6NH2的抑菌实验本实施例中的病原菌均来自于中国兽医微生物菌种保藏管理中心(CVCC),中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)、美国模式培养物集存库(ATCC)及猪场临床分离株系,具体菌株如表1所示。抗菌肽的最小抑菌浓度(MIC,minimuminhibitoryconcentration)的测定参照临床和实验室标准协会(CLSI,ClinicalandLaboratoryStandardsInstitute)制定的方法(WIEGAND等,Agarandbrothdilutionmethodstodeterminetheminimalinhibitoryconcentration(MIC)ofantimicrobialsubstances.Natureprotocols,2008,3(2):163-175),根据具体情况略有改动,操作细节如下:受试菌株的单菌落挑至MH液体培养基中,37℃250rpm振荡过夜培养活化后,转接至MH液体培养基中培养至对数生长期(OD600nm=0.4~0.6),然后制备成1×105CFU/mL的菌液,加入96孔无菌细胞培养板内,每孔90μL。用PBS通过2倍倍比稀释法对抗菌肽N6NH2进行稀释,每孔10μL,使其终浓度分别为128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125和0.0625μg/mL,阴性对照组为PBS代替抗菌肽的受试菌液,空白对照组为无菌MH培养基。每个处理3个平行样。将培养板置于37℃恒温培养箱孵育16~18h,直至阴性对照孔出现肉眼可见的明显浑浊菌液,能够完全抑制细菌生长的最低浓度即为抗菌肽对受试菌株的MIC值。若出现跳孔或平行样间结果不一致情况,则重新测试。结果如表1所示,抗菌肽N6NH2对大肠杆菌、沙门氏菌的MIC值为2~8μg/mL;对铜绿假单胞菌的MIC值为64μg/mL;对金黄色葡萄球菌、猪葡萄球菌的MIC值为8~32μg/mL,表明N6NH2对革兰氏阴性菌和阳性菌均表现出不同程度的抑菌效果。表1抗菌肽N6NH2的MIC值测定注:a为天津猪场临床分离株系。实施例3衍生肽N6NH2的血清稳定性、耐酸性检测分别将50μL的N6或N6NH2(50μM),在pH为2、4、6、8和10处理3h或置于25%血清中37℃孵育4h。测定处理后的肽溶液对E.coliCVCC195的抗菌活性,采用抑菌圈试验进行对比;用标准尺子测量抑菌圈的直径,记录绘图(图2、图3)。结果显示,N6和N6NH2在血清或不同pH值溶液中孵育不同时间后的抑菌圈直径几乎无明显变化;在pH=2时,N6NH2的耐酸性比N6提高了3本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.N6衍生肽在制备治疗细菌感染的抗菌药物或组合物中的应用,其特征在于,所述细菌为革兰氏阴性菌,包括埃希氏菌属(Escherichia)细菌、沙门氏菌属(Salmonella)细菌、假单胞菌属(Pseudomonas)细菌;其中,所述N6衍生肽是由序列如SEQ ID NO:1所示的抗菌肽N6的羧基末端经酰胺化得到的。

【技术特征摘要】
1.N6衍生肽在制备治疗细菌感染的抗菌药物或组合物中的应用,其特征在于,所述细菌为革兰氏阴性菌,包括埃希氏菌属(Escherichia)细菌、沙门氏菌属(Salmonella)细菌、假单胞菌属(Pseudomonas)细菌;其中,所述N6衍生肽是由序列如SEQIDNO:1所示的抗菌肽N6的羧基末端经酰胺化得到的。2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述细菌为革兰氏阴性菌,包括大肠杆菌(Escherichiacoli)、肠炎沙门氏菌(Salmonellaente...

【专利技术属性】
技术研发人员:王建华王振龙王秀敏滕达毛若雨郝娅杨娜
申请(专利权)人:中国农业科学院饲料研究所
类型:发明
国别省市:北京,11

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