一种富含绿原酸类物质金银花细胞的生产方法技术

本发明专利技术涉及一种富含绿原酸类物质金银花细胞的生产方法，该方法包括预处理、消毒、配制培养基、愈伤组织、继代培养、金银花细胞悬浮培养体系建立与后处理等步骤。本发明专利技术方法生产的产品绿原酸酸类物质含量高达9.68％以上，与现有生产方法自然金银花花蕾绿原酸含量4.82～4.84％(李淼，王永香，孟谨.HPLC法测定金银花中新绿原酸等8种成分的量[J].中草药，2014，45(7)：1006～1009)相比提高100～100.83％，生产周期缩短300～330天，通过成本核算确定成本降低70～80％。本发明专利技术方法易于实现工业化和自动化生产，便于广泛推广使用。

A Production Method of Honeysuckle Cells Rich in Chlorogenic Acids

The invention relates to a production method of honeysuckle cells rich in chlorogenic acid, which includes pretreatment, disinfection, preparation of culture medium, callus, subculture, establishment and post-treatment of honeysuckle cell suspension culture system. The chlorogenic acid content of the product produced by the method is as high as 9.68%, which is 100-100.83% higher than that of the natural honeysuckle flower bud produced by the existing production method, and the chlorogenic acid content is 4.82-4.84% (Li Zhao, Wang Yongxiang, Meng Jing. The content of neochlorogenic acid and other eight components in honeysuckle is determined by HPLC [J]. Chinese herbal medicine, 2014, 45(7):1006-1009), and the production cycle is shortened by 300-330 days. Cost accounting determines that the cost is reduced by 70-80%. The method of the invention is easy to realize industrialization and automation production, and is convenient for wide popularization and use.

【技术实现步骤摘要】
一种富含绿原酸类物质金银花细胞的生产方法
本专利技术属于生物
更具体地，本专利技术涉及一种富含绿原酸类物质金银花细胞的生产方法。
技术介绍
进入21世纪以来，健康成了人们追求的主题，人们崇尚自然、回归自然，利用现有的自然资源维持食品安全、防治疾病并保健康复身体，追求生命的自然健康，由此引发植物功能成分高效生产的研究热潮。绿原酸，又叫咖啡酰奎宁酸(Cafeoylquinicacid)，是重要的植物次生代谢产物，是植物体在有氧呼吸过程中经莽草酸途径形成的苯丙素类脂化合物家族，奎宁酸发生酯化因部位不同而分为3-O-咖啡酰奎宁酸(绿原酸)、4-O-咖啡酰奎宁酸(隐绿原酸)、5-O-咖啡酰奎宁酸(新绿原酸)、3,4-二-O-咖啡酰奎宁酸(异绿原酸B)、3,5-二-O-咖啡酰奎宁酸(异绿原酸A)、4,5-二-O-咖啡酰奎宁酸(异绿原酸C)等。绿原酸类物质为许多蔬菜、水果、饮品营养成分之一，也是众多药材(如金银花、茵陈、杜仲)以及中成药(如复肝宁、双花注射液、粉刺口服液)的主要有效成分和重要质量指标。现代药理研究表明，绿原酸具有多种生物活性，例如抑菌、抗炎、抗氧化、抗肿瘤与预防心血管疾病作用。在抑菌作用方面，Takahama(TakahamaU,TanakaM,HirotaS.Interactionbetweenascorbicacidandchlorogenicacidduringtheformationofnitricoxideinacidifiedsaliva[J].JournalofAgriculturalandFoodChemistry,2008,56(21):10406-10413)研究发现咖啡酰奎宁酸可抑制口腔细菌的滋生，预防牙周炎、牙槽脓肿等口腔疾病，维护口腔环境的健康；Albouchi(AlbouchiF,HassenI,CasabiancaH,HosniK*.Phytochemicals,antioxidant,antimicrobialandphytotoxicactivitiesofAilanthusaltissima(Mill.)Swingleleaves[J].SouthAfricanJournalofBotany,2013,87(7):164-174)发现富含绿原酸的椿嫩叶能较好地抑制革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和白色念珠菌；熊建华等人(XiongJH,LiSC,WangWJ,HongYP,TangKJ*,LuoQS.ScreeningandidentificationoftheantibacterialbioactivecompoundsfromLonicerajaponicaThunb.Leaves[J].FoodChemistry,2013,138:327-333；杨鹏飞，熊建华.金银花叶二-O-咖啡酰奎宁酸在肉品保鲜中的应用及其复合保鲜剂的开发[D].江西农业大学,2014)认为金银花叶中提取的咖啡酰奎宁酸类物质抑菌效果较好，对肉品有一定防腐作用，可延长冷藏猪肉、鸭肉保质期。在抗炎作用方面，Shan等人(ShanJH,FuJ,ZhaoZH,KongXQ,HuangH,LuoL*,YinZM*.Chlorogenicacidinhibitslipopolysaccharide-inducedCycfooxygenase-2expressioninRAW264.7cellsthroughsup-pressingNF-kappaBandJNK/AP-1activation[J].InternationalImmuno-pharmacology,2009,9(9):1042-1045)研究表明，前列腺素E2(PGE2)是重要的炎症介质，咖啡酰奎宁酸等酚性化合物通过抑制NF-kB、激活JNK/AP-1途径，抑制脂多糖诱导的环氧合酶-2的mRNA和蛋白质的表达，抑制前列腺素E2，从而产生抗炎药理作用。在抗氧化作用方面，咖啡酰奎宁酸具有较好清除自由基作用，通过捕捉自由基正离子发挥抗氧化作用，对红细胞溶血和DNA氧化产生保护作用。在抗肿瘤作用方面，咖啡酰奎宁酸通过抑制细胞生长、调节细胞周期、诱导凋亡等途径产生抗癌作用。目前一些研究表明，咖啡酰奎宁酸可预防结肠癌、口腔癌、肝癌等疾病的发生。在预防心血管疾病作用方面，一些研究表明，咖啡酰奎宁酸能够保护心肌免受多柔比星引起的氧化反应，且可显著抑制铁离子依赖性多柔比星诱导的心肌细胞内微粒体及线粒体膜的过氧化。另外，咖啡酰奎宁酸还具有预防、治疗糖尿病，急性咽喉炎症、化脓性皮肤病和抵抗乙肝病毒等效果。随着绿原酸生物活性研究的不断深入，它的应用更加广泛，涉及食品、保健品、医药和日常生化用品等多个领域。在食品与保健品工业方面，咖啡酰奎宁酸具有利胆、抗菌、抗病毒、止血和兴奋中枢神经系统生理功能，因此，它可以用于制作食品、保健食品或饮料。咖啡酰奎宁酸具有抑菌、抗氧化作用，可有效防止饮料和食品的腐败变质，因此，咖啡酰奎宁酸又是一种良好的食品添加剂。在日用化妆业方面，Cinkilic等人(CinkilicN,CetintasSK,ZorluT,VatanO,YilmazD,CavasT,TuncS,OzkanL,BilalogluR.Radioprotectionbytwophenoliccompounds:Chlorogenicandquinicacid,onX-rayinducedDNAdamageinhumanbloodlymphocytesinvitro[J].FoodandChemicalToxicology,2013,53(3):359-363)认为，以咖啡酰奎宁酸为代表的天然多酚物质可以保护胶原蛋白不受活性氧等自由基伤害，并能有效防止紫外线对人体皮肤产生伤害作用，例如多项专利申请都涉及咖啡酰奎宁酸用于制备抗脲酶化妆品、皮肤防晒霜、防止染发剂对头发损伤的洗发水。在医药工业方面，卫生部部颁《药品标准》收录了170种具有清热解毒、抗菌消炎的中成药，它们均含有绿原酸等咖啡酰奎宁酸主要成分。目前在银黄制剂、双黄连制剂等药品的生产中，已将绿原酸作为质量控制的重要指标之一，从植物中提取纯的绿原酸，可作为二类新药。绿原酸还是很重要化学试剂，在生理生化分析和化学工业中具有广泛应用，高效获取绿原酸类物质具有巨大的社会和经济效益。绿原酸广泛存在植物中，但含量较高的植物不多，其中包括金银花、杜仲、向日葵、继花、咖啡、可可树。金银花，又名忍冬花，是绿原酸为数不多含量较高的植物之一，为忍冬科植物忍冬(LonicerajaponicaThunb.)的干燥花蕾或初放的花，金银花花蕾为一种常用饮品、中药原材料，近年来，随着金银花需求增大，金银花在我国已进行广泛的人工栽培，栽培的主要地区是山东、河南、湖南、江西、广西、贵州、重庆等省市区，江西仅德安金银花种植面积就将增至10万亩，金银花产业已成为江西省乃至我国山区特色农业经济，规模和产量都较大。但是，金银花是我国常见饮品、中药的原材料，并作为提取绿原酸等咖啡酰奎宁酸的工业原料，用量较大，价格较高。而且金银花花期较短，产量有限，稀缺的资源严重制约着绿原酸的开发和利用。植物细胞组织培养的研究开始于1902年，德国著名植物本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种富含绿原酸类物质金银花细胞的生产方法，其特征在于该方法的步骤如下：A、预处理金银花嫩芽先用清水冲洗，再放到洗衣粉溶液中浸泡，接着用清水冲洗干净，晾干；B、消毒步骤A得到的晾干金银花嫩芽在酒精溶液中进行消毒处理，接着在次氯酸钠水溶液中进行消毒处理；消毒处理的金银花嫩芽用无菌水冲洗3～5次，接着置于无菌滤纸上吸干水分，再在无菌条件下将金银花嫩芽切成尺寸为0.4～0.6cm的切伤金银花嫩芽段；C、配制培养基(i)愈伤组织诱导培养基称取4.74gMS培养基粉、7g琼脂与30g蔗糖，加水溶解胀，在微波功率800W下加热6min使其溶解，制成1LMS固体培养基，再加入NAA、KT、2,4‑D与6‑BA植物激素，使它们的浓度分别达到1.5mg/LNAA、0.75mg/LKT、1.0mg/L2,4‑D与0.15mg/L6‑BA，混合均匀，得到的溶液再使用无机酸或无机碱水溶液将其pH值调节至5.8，然后按照50mL/瓶分装于培养瓶中，置于灭菌锅中灭菌，接着冷却至室温，得到所述的愈伤组织诱导培养基。(ii)继代培养基称取4.74g MS培养基粉、7g琼脂与30g蔗糖，加水溶解制成1L MS固体培养基，再加入6‑BA、NAA与2,4‑D植物激素，使它们的浓度分别达到1.5mg/L 6‑BA、0.2mg/LNAA与0.1mg/L 2,4‑D，混合均匀，得到的溶液再使用无机酸或无机碱水溶液将其pH值调节至5.8，然后按照50mL/瓶分装于培养瓶中，置于灭菌锅中灭菌，接着冷却至室温，得到所述的继代培养基。(iii)细胞悬浮培养基往4.74g/L液体MS培养基中加入6‑BA、NAA、2,4‑D植物激素与蔗糖，使它们的浓度分别达到1.4mg/L 6‑BA、0.5mg/LNAA、0.7mg/L 2,4‑D以及30g/L蔗糖，混合均匀，得到的溶液再使用无机酸或无机碱水溶液将其pH值调节至5.8，然后置于灭菌锅中灭菌，接着冷却至室温，得到所述的细胞悬浮培养基。D、愈伤组织在无菌的条件下，把步骤B的切伤金银花嫩芽段接种到步骤C(i)制备的愈伤组织诱导培养基上，在人工智能气候箱中暗培养9天，接着在有光与黑暗的条件下交替培养，其中每天在光照2000lux下培养14h，在培养6～8天后，金银花嫩芽在伤口处长出愈伤组织，20～24天愈伤组织生长量达到高峰，此时在无菌条件下取出愈伤组织；E、继代培养在无菌的条件下，把步骤D取出的愈伤组织接种到步骤C(ii)制备的继代培养基中，放置于人工气候箱中进行光、暗交替培养，光照强度为2000lx，光照时间为14h·d...

【技术特征摘要】
1.一种富含绿原酸类物质金银花细胞的生产方法，其特征在于该方法的步骤如下：A、预处理金银花嫩芽先用清水冲洗，再放到洗衣粉溶液中浸泡，接着用清水冲洗干净，晾干；B、消毒步骤A得到的晾干金银花嫩芽在酒精溶液中进行消毒处理，接着在次氯酸钠水溶液中进行消毒处理；消毒处理的金银花嫩芽用无菌水冲洗3～5次，接着置于无菌滤纸上吸干水分，再在无菌条件下将金银花嫩芽切成尺寸为0.4～0.6cm的切伤金银花嫩芽段；C、配制培养基(i)愈伤组织诱导培养基称取4.74gMS培养基粉、7g琼脂与30g蔗糖，加水溶解胀，在微波功率800W下加热6min使其溶解，制成1LMS固体培养基，再加入NAA、KT、2,4-D与6-BA植物激素，使它们的浓度分别达到1.5mg/LNAA、0.75mg/LKT、1.0mg/L2,4-D与0.15mg/L6-BA，混合均匀，得到的溶液再使用无机酸或无机碱水溶液将其pH值调节至5.8，然后按照50mL/瓶分装于培养瓶中，置于灭菌锅中灭菌，接着冷却至室温，得到所述的愈伤组织诱导培养基。(ii)继代培养基称取4.74gMS培养基粉、7g琼脂与30g蔗糖，加水溶解制成1LMS固体培养基，再加入6-BA、NAA与2,4-D植物激素，使它们的浓度分别达到1.5mg/L6-BA、0.2mg/LNAA与0.1mg/L2,4-D，混合均匀，得到的溶液再使用无机酸或无机碱水溶液将其pH值调节至5.8，然后按照50mL/瓶分装于培养瓶中，置于灭菌锅中灭菌，接着冷却至室温，得到所述的继代培养基。(iii)细胞悬浮培养基往4.74g/L液体MS培养基中加入6-BA、NAA、2,4-D植物激素与蔗糖，使它们的浓度分别达到1.4mg/L6-BA、0.5mg/LNAA、0.7mg/L2,4-D以及30g/L蔗糖，混合均匀，得到的溶液再使用无机酸或无机碱水溶液将其pH值调节至5.8，然后置于灭菌锅中灭菌，接着冷却至室温，得到所述的细胞悬浮培养基。D、愈伤组织在无菌的条件下，把步骤B的切伤金银花嫩芽段接种到步骤C(i)制备的愈伤组织诱导培养基上，在人工智能气候箱中暗培养9天，接着在有光与黑暗的条件下交替培养，其中每天在光照2000lux下培养14h，在培养6～8天后，金银花嫩芽在伤口处长出愈伤组织，20～24天愈伤组织生长量达到高峰，此时在无菌条件下取出愈伤组织；E、继代培养在无菌的条件下，把步骤D取出的愈伤组织接种到步骤C(ii)制备的继代培养基中，放置于人工气候箱中进行光、暗交替培养，光照...

【专利技术属性】
技术研发人员：熊建华，李冬梅，杜娟，杜华英，胡昭君，罗秋水，
申请(专利权)人：江西农业大学，
类型：发明
国别省市：江西,36