基于TdT-RCA的传感器及其在DNA甲基转移酶检测中的应用制造技术

本发明专利技术提供一种基于TdT‑RCA的传感器及其在DNA甲基转移酶检测中的应用，该传感器包括：Dam甲基转移酶检测探针、哑铃状滚环模板。本发明专利技术通过对甲基转移酶作用的底物发夹探针3’末端进行氨基化修饰有效地防止末端转移酶(TdT)激活的非特异性扩增，降低了背景信号，从而极大提高本发明专利技术检测方法的特异性；将TdT催化的引物延伸和哑铃状模板介导的滚环扩增(RCA)反应结合，以硫黄素T(ThT)为荧光染料(与反应产物G三链特异结合作为信号输出)无需荧光标记，操作简单，降低了实验成本；能较好区分Dam甲基转移酶和其他甲基转移酶，具有较好的选择性。

Sensor Based on TdT-RCA and Its Application in DNA Methyltransferase Detection

The invention provides a sensor based on TdT_RCA and its application in DNA methyltransferase detection. The sensor comprises a Dam methyltransferase detection probe and a dumbbell-shaped rolling ring template. The invention effectively prevents the nonspecific amplification of terminal transferase (TdT) activation by aminating the 3'end of the substrate hairpin probe for methyltransferase, reduces the background signal, thereby greatly improving the specificity of the detection method of the invention; combines the primer extension catalyzed by TdT with the dumbbell template-mediated rolling ring amplification (RCA) reaction, and uses Thioflavin T (ThT) as fluorescence. Dyes (specifically bound to the G triplex as signal output) do not need fluorescent labeling and are easy to operate, which reduces the cost of the experiment. They can distinguish Dam methyltransferase from other methyltransferases and have good selectivity.

【技术实现步骤摘要】
基于TdT-RCA的传感器及其在DNA甲基转移酶检测中的应用
本专利技术涉及生物分析
，特别是涉及一种基于TdT-RCA的传感器及其在DNA甲基转移酶检测中的应用。
技术介绍
DNA甲基化是一种众所周知的表观遗传事件，在调控基因表达、细胞分化和基因组稳定性方面起着至关重要的作用。通常，DNA甲基化过程通过DNA甲基转移酶进行，其催化S-腺苷甲硫氨酸(SAM)中的甲基基团共价添加到识别序列中的靶腺嘌呤或胞嘧啶残基。异常的DNA甲基转移酶活性可能导致异常的DNA甲基化模式，这与各种遗传疾病和人类恶性肿瘤密切相关。DNA甲基转移酶已成为各种癌症诊断和治疗的潜在生物标志物和治疗靶点。因此，对DNA甲基转移酶活性的敏感和准确评估以及其抑制剂的筛选在临床诊断和治疗中具有重要意义。目前，高效液相色谱法(HPLC)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、凝胶电泳和放射性标记测定法等传统方法已被应用于甲基转移酶的检测。然而，这些方法需要放射性试剂，复杂的样品制备和昂贵的仪器，增加了实验成本的同时也增加了实验的复杂程度，且灵敏度低，这些缺点限制了它们在实践中的广泛使用。为了解决这些问题，近年来，许多研究致力于构建更安全、简便的方法用于DNA甲基转移酶的检测。电化学方法、比色法、荧光测定法具有直观、简便、安全的优点，然而这些方法一般需要繁琐的纳米材料制备，复杂的序列设计，依赖荧光基团和猝灭基团对探针进行标记，分析检测时间长，涉及复杂的序列设计且费用高昂。电化学方法响应速度快，设计成本低，但复杂的电极表面修饰处理限制了它的应用。核酸扩增方法的引入可以极大提高检测灵敏度，然而现有的核酸扩增通常需要核酸内切酶的特异识别序列以及荧光标记的核酸底物，加大了方案设计的难度和实验复杂性。因此，迫切需要开发一种操作简单、无需荧光标记的用于高灵敏检测DNA甲基转移酶的方法。
技术实现思路
鉴于以上所述现有技术的缺点，本专利技术的目的在于提供一种检测DNA腺嘌呤甲基转移酶的荧光传感器及制备与应用，用于解决现有技术中DNA甲基转移酶的检测所需序列复杂、成本高昂、操作过程繁琐、方案设计的难度大等问题。为实现上述目的及其他相关目的，本专利技术提供一种检测Dam甲基转移酶的荧光传感器，包括：Dam甲基转移酶检测探针、哑铃状滚环模板。可选地，所述Dam甲基转移酶检测探针为具茎环结构的DNA发夹探针，所述DNA发夹探针含5’-G-A-T-C-3’的回文序列，供Dam甲基转移酶特异性识别；所述检测探针3’末端使用氨基修饰。可选地，所述哑铃状滚环模板由环部包含富T序列及富C序列的DNA发卡探针合成；所述DNA发卡探针5’端进行磷酸化修饰。可选地，所述Dam甲基转移酶检测探针长度为38nt。可选地，所述Dam甲基转移酶检测探针含有如SEQIDNO.1所示序列：5’-AGAAGGATCTTATCGACTTGCTTAAGATCCTTCTTAAT-NH2-3’(SEQIDNO.1)，所述检测探针的3’端进行氨基修饰。可选地，所述用于合成哑铃状滚环模板的DNA发卡探针长度为62nt。可选地，所述用于合成哑铃状滚环模板的DNA发卡探针含有如SEQIDNO.2所示序列：5’-P-ATTCGTAGACCCGCCCTACCCATCAGCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCATACGCTACGAAT-3’(SEQIDNO.2)，序列中下划线部分的碱基是指形成发夹后的双链互相杂交的部分。可选地，所述荧光传感器还包括S-腺苷甲硫氨酸(SAM)，通常，购买Dam甲基转移酶及其缓冲液时，供应商会随酶提供SAM，SAM的英文名：S-Adenosyl-L-methionine，化学式：C15H23N6O5S，分子量399.44，CAS登录号：29908-03-0。可选地，所述荧光传感器还包括荧光染料，该荧光染料即为指示剂。可选地，所述荧光染料选自硫黄素T(ThT)，该染料可与反应后的产物特异结合，硫黄素TCAS号:2390-54-7，分子式:C17H19ClN2S，分子量:318.8642，该染料可以从市场上购买得到。可选地，所述荧光染料浓度为5μM。可选地，所述荧光传感器还包括Dam甲基转移酶及其反应缓冲液、依赖甲基化的限制性内切酶DpnI及其反应缓冲液、末端转移酶(TdT)及其反应缓冲液、Phi29DNA聚合酶及其反应缓冲液、脱氧三磷酸腺苷(dATPs)、扩增原料dNTPs，上述各试剂均可从市场上购买得到。本专利技术还提供利用上述荧光传感器检测Dam甲基转移酶的方法，包括如下步骤：(a)将待测样品加入反应溶液I中进行孵育反应，然后进行高温灭活处理；(b)向步骤(a)高温灭活处理后的溶液中加入反应溶液II，进行末端转移酶催化的聚合反应；(c)取步骤(b)所得聚合产物，加入反应溶液Ⅲ进行滚环扩增反应；(d)对步骤(c)反应后的溶液进行荧光检测，实现对待测样品中Dam甲基转移酶的定量分析。可选地，所述步骤(a)的所述反应溶液I中包括：Dam甲基转移酶反应缓冲液、DpnI反应缓冲液、Dam甲基转移酶检测探针、SAM、DpnI、Dam甲基转移酶。可选地，所述步骤(a)中，所述待测样品与所述反应溶液I混合后，所得的混合液中包括：1×Dam甲基转移酶反应缓冲液、1×DpnI反应缓冲液、1μMDam甲基转移酶检测探针、96～192μMSAM、1～6UDpnI、0.1～40U/mLDam甲基转移酶。可选地，所述步骤(a)中，所述待测样品与所述反应溶液I混合后，所得的混合液中包括：1×Dam甲基转移酶反应缓冲液、1×DpnI反应缓冲液、1μMDam甲基转移酶检测探针、160～192μMSAM、4～6UDpnI和0.1～40U/mL的Dam甲基转移酶。可选地，所述步骤(a)中，孵育反应条件为：37℃，孵育时间为1h。可选地，所述步骤(a)中，高温灭活处理温度为80℃，灭活时间为20min。可选地，所述步骤(b)中，所述反应溶液II包括：末端转移酶及其反应缓冲液、dATPs。可选地，所述步骤(b)中，加入所述反应溶液II后，所得的混合液中包括：4～14U末端转移酶、0.5mMdATP、1x末端转移酶反应缓冲液。可选地，所述步骤(b)中，加入所述反应溶液II后，所得的混合液中包括：10～14U末端转移酶、0.5mMdATP、1x末端转移酶反应缓冲液。可选地，所述步骤(b)中，孵育反应条件为：37℃，孵育时间为40min。可选地，所述步骤(b)中，高温灭活处理温度为75℃，灭活时间为10min。可选地，所述步骤(c)中，所述反应溶液Ⅲ包括dNTPs、Phi29DNA聚合酶及其反应缓冲液、滚环模板、硫黄素T可选地，所述步骤(c)中，加入所述反应溶液Ⅲ后，所得的混合液中包括：1.7mMdNTPs、4～14UPhi29DNA聚合酶、0.5μM滚环模板、5μM硫黄素T、1xPhi29DNA聚合酶缓冲液。可选地，所述步骤(c)中，加入所述反应溶液Ⅲ后，所得的混合液中包括：1.7mMdNTPs、10～14UPhi29DNA聚合酶、0.5μM滚环模板、5μM硫黄素T、1xPhi29DNA聚合酶缓冲液。可选地，所述步骤(c)中，孵育反应条件为：30℃，避光孵育时间为1h。上述的缓冲液，所有原始浓度的缓冲液均为10x缓冲液，加到本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测Dam甲基转移酶的荧光传感器，其特征在于，包括：Dam甲基转移酶检测探针、哑铃状滚环模板。

【技术特征摘要】
1.一种检测Dam甲基转移酶的荧光传感器，其特征在于，包括：Dam甲基转移酶检测探针、哑铃状滚环模板。2.根据权利要求1所述的荧光传感器，其特征在于：所述Dam甲基转移酶检测探针为具茎环结构的DNA发夹探针，所述DNA发夹探针含5’-G-A-T-C-3’的回文序列，供Dam甲基转移酶特异性识别；所述检测探针3’末端使用氨基修饰。3.根据权利要求2所述的荧光传感器，其特征在于：所述Dam甲基转移酶检测探针长度为38nt，优选地，所述Dam甲基转移酶检测探针含有如SEQIDNO.1所示序列：5’-AGAAGGATCTTATCGACTTGCTTAAGATCCTTCTTAAT-NH2-3’(SEQIDNO.1)。4.根据权利要求1所述的荧光传感器，其特征在于：所述哑铃状滚环模板由环部包含富T序列及富C序列的DNA发卡探针合成；所述DNA发卡探针5’端进行磷酸化修饰。5.根据权利要求4所述的荧光传感器，其特征在于：用于合成所述哑铃状滚环模板的DNA发卡探针长度为62nt，优选地，所述用于合成哑铃状滚环模板的DNA发卡探针含有如SEQIDNO.2所示序列：5’-P-ATTCGTAGACCCGCCCTACCCATCAGCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCATACGCTACGAAT-3’(SEQIDNO.2)。6.根据权利要求1所述的荧光传感器，其特征在于：所述荧光传感器还包括S-腺苷甲硫氨酸(SAM)。7.根据权利要求1所述的荧光传感器，其特征在于：还包括荧光染料，优选地，所述荧光染料选自硫黄素T。8.根据权利要求1所述的荧光传感器，其特征在于，还包括：Dam甲基转移酶及其反应缓冲液、依赖甲基化的限制性内切酶DpnI及其反应缓冲液、末端转移酶(TdT)及其反应缓冲液、Phi29DNA聚合酶及其反应缓冲液、脱氧三磷酸腺苷(dATPs)、扩增原料dNTPs。9.利用权利要求1-8任意一项所述荧光传感器检测Dam甲基转移酶的方法，其特征在于：包括如下步骤：(a)将待测样品加入反应溶液I中进行孵育反应，然后进行高温灭活处理；(b)向步骤(a)高温灭活处理后的溶液中加入反应溶液II，进行末端转移酶催化的聚合反应；(c)取步骤(b)所得聚合产物，加入反应溶液Ⅲ进行滚环扩增反应；(d)对步骤(c)反应后的溶液进行荧光检测，实现对待测样品中...

【专利技术属性】
技术研发人员：颜玉蓉，丁世家，程伟，晏小玉，马洪敏，阙海英，王通，刘萍，甘秀锋，
申请(专利权)人：重庆医科大学，
类型：发明
国别省市：重庆,50