本发明专利技术公开了一种褐色橘蚜Hunchback基因，序列如SEQ ID NO:3所示；还公开了该Hunchback基因的dsRNA，序列如SEQ ID NO:6所示；还公开了一种褐色橘蚜Hunchback基因的dsRNA的合成方法：提取总RNA，反转录为cDNA，以SEQ ID NO:4的引物和SEQ ID NO:5的引物进行PCR扩增，PCR扩增产物进行电泳后回收产物，以胶回收产物为模板合成得到dsRNA。还公开了一种新型蚜虫RNAi方法：将褐色橘蚜背部朝上固定，将Hunchback基因的dsRNA点滴于褐色橘蚜腹部背面，待dsRNA液被充分吸收至体表变干后，将褐色橘蚜放入培养箱饲喂。
Hunchback gene, dsRNA and synthesis method of brown citrus aphid and new aphid RNAi method
The invention discloses a Hunchback gene of the brown citrus aphid, whose sequence is shown in SEQ ID NO:3; also discloses the dsRNA of the Hunchback gene, whose sequence is shown in SEQ ID NO:6; and also discloses a synthesis method of the dsRNA of the Hunchback gene of the brown citrus aphid: extracting total RNA, retranscribing it to DNA, amplifying by PCR with SEQ ID NO:4 primers and SEQ ID NO:5 primers, and amplifying products by PCR. The product was recovered after electrophoresis, and dsRNA was synthesized using the gel recovery product as template. A new method of RNAi for aphids is also disclosed. The dorsal part of the brown citrus aphid is fixed upward. The dsRNA of Hunchback gene is dripped on the back of the abdomen of the brown citrus aphid. After the dsRNA solution is fully absorbed into the body surface and dried, the brown citrus aphid is fed in the incubator.
【技术实现步骤摘要】
褐色橘蚜Hunchback基因、dsRNA和合成方法以及新型蚜虫RNAi方法
本专利技术涉及昆虫的生长发育调控和基因工程领域，特别涉及一种褐色橘蚜Hunchback基因、dsRNA和合成方法以及新型蚜虫RNAi方法。
技术介绍
褐色橘蚜(Toxopteracitricida)是一种世界性的柑橘害虫，同时是柑橘衰退病病毒的主要传播媒介，对柑橘产量和品质影响较大，目前化学防治仍是控制褐色橘蚜的重要措施。化学农药施用不当，不仅影响果品安全，同时还会导致严重的抗药性。RNA干扰(RNAinterference，RNAi)是近年来发现的一种重要基因沉默手段，是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA(dsRNA，Double-strandedRNA，双链核糖核酸)诱发的、同源RNA高效特异性降解的现象，是通过dsRNA的介导特异性的降解对应序列的mRNA。由于使用RNAi技术可以特异性抑制特定基因的表达，所以该技术已被广泛用于探索基因功能和基因治疗领域。Hunchback基因是一种间隙基因，是重要的胚胎发育相关基因，调控着昆虫的体节发育。经前人研究，控制果蝇体节发生的基因包括间隙基因(gapgene)、成对规则基因(pair-rulegene)以及体节极性基因(segmentpolaritygene)。间隙基因的突变会导致胚胎体节图式出现空缺，即成串的副体节发生丢失，其中Hunchback是抑制腹部形成的专一胚胎基因，调节了超双胸基因(ultrabithorax)在前后体节表达的分布。在豌豆蚜中，Hunchback基因在胚胎发育时期调控着前端体节的形成。但是目前尚未有针对褐色橘蚜Hunchback基因以及其dsRNA的相关报道。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题在于克服已有技术的缺陷，提供一种褐色橘蚜Hunchback基因、dsRNA和合成方法以及新型蚜虫RNAi方法。本专利技术的技术方案如下：一种褐色橘蚜Hunchback基因，其序列如SEQIDNO:3所示。一种褐色橘蚜Hunchback基因的dsRNA，其序列如SEQIDNO:6所示。一种褐色橘蚜Hunchback基因的dsRNA的合成方法，包括如下步骤：提取褐色橘蚜的总RNA，反转录成为cDNA作为扩增模板，以序列为SEQIDNO:4的上游引物和以序列为SEQIDNO:5的下游引物进行PCR扩增，PCR扩增产物进行电泳后回收产物，以胶回收产物为模板合成得到褐色橘蚜Hunchback基因的dsRNA。在上述技术方案中，PCR扩增时25μl的PCR反应体系包括：浓度为800-1200ng/μl的cDNA模板0.5μl，浓度为0.15-0.25μM的上、下游引物各1μl，PrimeSTARMaxPremix12.5μl以及去核酸酶水10μl。在上述技术方案中，PCR反应条件为：95℃预变性3min；95℃变性30s、60℃退火10s、72℃延伸2min，共35个循环；72℃条件下延伸10min。一种新型蚜虫RNAi方法，包括如下步骤：将褐色橘蚜背部朝上固定，用微量移液器吸取前述的褐色橘蚜Hunchback基因的dsRNA的溶液，将dsRNA点滴于褐色橘蚜腹部背面，待dsRNA液被充分吸收至体表变干后，将褐色橘蚜放入培养箱饲喂。本专利技术的有益效果是：本专利技术鉴定得到褐色橘蚜Hunchback基因序列，并根据该序列得到Hunchback基因的dsRNA，可以应用于对褐色橘蚜进行RNA干扰从而起到防治褐色橘蚜的效果。通过实验验证，该dsRNA基因沉默效率高，基因干扰后褐色橘蚜有明显表型变化，解决了褐色橘蚜目前没有有效的Hunchback基因的dsRNA的问题，在研发新型杀虫剂方面有很好的应用前景。同时建立了一种新型的简易高效的dsRNA递送方式，能引起基因的剧烈下调，具有靶向干扰褐色橘蚜从而进行生物防治的潜力，通过实验验证，该dsRNA递送方发简易可行，具有巨大应用潜力，且靶标基因沉默效率高，解决了褐色橘蚜目前没有有效的Hunchback基因的dsRNA的问题，在研发新型杀虫剂方面有很好的应用前景。附图说明图1为褐色橘蚜Hunchback基因在NCBI中ProteinBlast比对图。图2为褐色橘蚜Hunchback基因氨基酸序列与其它昆虫Hunchback转运蛋白系统发育树图。图3为本专利技术实施例三中使用的褐色橘蚜饲喂装置。图4为本专利技术实施例三用微量移液器对褐色橘蚜递送dsRNA的操作示意图。图5为褐色橘蚜递送Hunchback基因的dsRNA后的Hunchback基因相对表达量，其中GFP表示对照组，dsHunchback表示实验组。具体实施方式本专利技术实施例所用化学试剂来源如下：LATaqMIX(Takara公司,日本)TRIzolkit(Invitrogen公司，美国)RNeasyPlusMicroKit(QIAGEN公司，德国)PrimeSTARMaxPremix(Takara公司,日本)胶回收纯化试剂盒(Takara公司,日本)TranscriptAidT7HighYieldTranscriptionKit(ThermofisherScientific公司，美国)PerfectrealtimeRTreagent(Takara公司，日本)qPCRMasterMix(Promega公司，美国)TranscriptAidEnzymeMix(ThermofisherScientific公司，美国)ATP/CTP/GTP/UTPMix(ThermofisherScientific公司，美国)PrimeScriptRTEnzymeMixI(ThermofisherScientific公司，美国)OligodTPrimer(ThermofisherScientific公司，美国)Random6mers(ThermofisherScientific公司，美国)实施例一、褐色橘蚜ABCG4基因序列鉴定1)从褐色橘蚜转录组数据(西南大学昆虫学与害虫控制重点实验室提供)中查找可能的HunchbackUnigene序列，通过tBlastn，在转录组当中查找到一条unigene序列。2)利用RNA提取试剂盒RNeasyPlusMicroKit按照使用说明提取褐色橘蚜的总RNA，然后利用反转录试剂盒PerfectrealtimeRTreagent按照使用说明将1μg总RNA反转录成为cDNA。3)以上述得到的cDNA为模板，设计扩增引物,利用上下游引物Hunchback-A和Hunchback-S进行PCR扩增；PCR条件为：95℃预变性3min；95℃变性30s、60℃退火10s、72℃延伸2min，共35个循环；72℃条件下延伸10min。PCR反应体系共25μl，包括：浓度为1000ng/μl的cDNA模板1μl，浓度为0.15-0.25μM的上下游引物各1μl，LATaqMIX0.25μl，10×Buffer(Mg2+plus)3μl，dNTP4μl以及去核酸酶水14.75μl；引物Hunchback-A(如SEQIDNO:1所示)和Hunchback-S(如SEQIDNO:2所示)的序列如下：Hunchback-A：TGCGACTACAAGTGCGTGAG；Hunchbac本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种褐色橘蚜Hunchback基因，其特征在于，序列如SEQ ID NO:3所示。
【技术特征摘要】
1.一种褐色橘蚜Hunchback基因，其特征在于，序列如SEQIDNO:3所示。2.一种褐色橘蚜Hunchback基因的dsRNA，其特征在于，序列如SEQIDNO:6所示。3.一种褐色橘蚜Hunchback基因的dsRNA的合成方法，其特征在于，包括如下步骤：提取褐色橘蚜的总RNA，反转录成为cDNA作为扩增模板，以序列为SEQIDNO:4的上游引物和以序列为SEQIDNO:5的下游引物进行PCR扩增，PCR扩增产物进行电泳后回收产物，以胶回收产物为模板合成得到褐色橘蚜Hunchback基因的dsRNA。4.如权利要求3所述的褐色橘蚜Hunchback基因的dsRNA的合成方法，其特征在于，PCR扩增时25μl的PCR反应体系包括：浓度为800...
【专利技术属性】
技术研发人员：王进军，杨婉君，牛金志，尚峰，
申请(专利权)人：西南大学，
类型：发明
国别省市：重庆,50
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。