The invention belongs to the technical field of porcine pseudorabies virus, and discloses a pig pseudorabies recombinant virus strain and a construction method thereof. The recombinant virus strain is rPRV_gE.
【技术实现步骤摘要】
一种猪伪狂犬病重组病毒株及其构建方法
本专利技术属于猪伪狂犬病病毒
，具体涉及一种猪伪狂犬病重组病毒株及其构建方法。
技术介绍
猪繁殖与呼吸综合征（porcinereproductiveandrespiratorysyndrome,PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus,PRRSV）引起的怀孕母猪在妊娠后期出现流产、早产或死产的繁殖障碍和新生仔猪的呼吸系统症状。自1987在美国发现以来，PRRSV已有快30年的历史。在中国自从1996年郭宝清首次分离到PRRSV以来，已有20年历史，世界上已陆续有不少国家出现了PRRSV，每年都给养殖业造成巨大的经济损失。感染PRRSV猪体液免疫产生的抗体主要是针对PRRSV结构蛋白的抗体，如：N蛋白、M蛋白和GP5蛋白。研究表明，猪接种PRRSV后7天就可检出N蛋白的特异性抗体，9～35天后可检出针对M蛋白的抗体。目前证明N蛋白抗体对病毒没有中和作用。PRRSV的主要中和性表位存在于GP5蛋白上，感染后7天即可检出GP5抗体，但针对GP5的非中和性抗体的出现早于其中和性抗体。这主要是由于位于GP5蛋白中和表位B之前非中和表位A对中和表位产生覆盖效应，导致中和表位B不能充分暴露，从而不能有效诱发较高的中和抗体。目前已有研究证实通过在ORF5基因的96位和97位核苷酸之间引入PADRE表位的修饰型ORF5m基因可以诱导机体产生更为高的中和抗体水平，这主要是去除了非中和表位A对中和表位B的覆盖性效应。2012年初以来，许多使用猪伪...
【技术保护点】
1.一种猪伪狂犬病重组病毒株，其特征在于：所述重组病毒株为rPRV‑gE
【技术特征摘要】
1.一种猪伪狂犬病重组病毒株，其特征在于：所述重组病毒株为rPRV-gE-/TK-/GP5+/M+、rPRV-gE-/TK-/GP5+/M+/IL-18+、rPRV-gE-/TK-/GP5m+、rPRV-gE-/TK-/GP5m+/IL-18+或rPRV-gE-/TK-/IL-18+，其中GP5m是指修饰型GP5。2.一种如权利要求1所述的猪伪狂犬病重组病毒株的构建方法，其特征在于：（1）、设计PCR扩增GP5、G-GP5m、D-GP5m、G-2A-M、D-2A-M、2A-IL-18、IL-18、表达框的引物，分别为：G-GP5mF：如SEQIDNo.1所示；G-GP5mR：如SEQIDNo.2所示；D-GP5mF：如SEQIDNo.3所示；D-GP5mR：如SEQIDNo.4所示；G-2A-MF：如SEQIDNo.5所示；G-2A-MR：如SEQIDNo.6所示；D-2A-MF：如SEQIDNo.7所示；D-2A-MR：如SEQIDNo.8所示；2A-IL-18F：如SEQIDNo.9所示；2A-IL-18R：如SEQIDNo.10所示；GP5F：如SEQIDNo.11所示；GP5R：如SEQIDNo.12所示；IL-18F：如SEQIDNo.13所示；IL-18R：如SEQIDNo.14所示；CMVF：如SEQIDNo.15所示；PolyR：如SEQIDNo.16所示；其中：G-GP5mF和G-GP5mR用于构建重组质粒pZJ-GP5m-2A-IL-18的GP5m序列扩增；D-GP5mF和D-GP5mR用于构建重组质粒pZJ-GP5m的GP5m序列扩增；G-2A-MF和G-2A-MR用于构建重组质粒pZJ-GP5-2A-M-2A-IL-18的2A-M序列扩增；D-2A-MF和D-2A-MR用于构建重组质粒pZJ-GP5-2A-M的2A-M序列扩增；2A-IL-18F和2A-IL-18R用于构建重组质粒pZJ-GP5-2A-M-2A-IL-18和pZJ-GP5m-2A-IL-18的2A-IL-18序列扩增；GP5F和GP5R用于构建重组质粒pZJ-GP5-2A-M-2A-IL-18和pZJ-GP5-2A-M的GP5序列扩增；IL-18F和IL-18R用于构建重组质粒pZJ-IL-18的IL-18序列扩增；CMVF、PolyAR用于扩增含有CMV、外源性基因、PolyA的完整表达框；其中，G-GP5m不含GP5m基因的终止密码子，D-GP5m含GP5m基因的终止密码子，G-2A-M含有2A肽序列但不含M基因的终止密码子，D-2A-M含有2A肽序列和M基因的终止密码子，2A-IL-18含有2A肽序列和IL-18基因的终止密码子，GP5不含GP5基因的终止密码子，IL-18含IL-18基因的终止密码子；（2）、外源性基因GP5、G-GP5m、D-GP5m、G-2A-M、D-2A-M、2A-IL-18、IL-18的RT-PCR扩增从PRRSVATCC-VR2332中提取RNA，采用引物Random进行RT反应；以RT反应的产物cDNA为模板，应用PCR技术通过高保真聚合酶GXL扩增外源性基因，扩增完成后，琼脂糖凝胶电泳并回收外源性基因片段，备用；（3）、重组质粒pZJ-GP5-2A-M、pZJ-GP5-2A-M-2A-IL-18、pZJ-GP5m、pZJ-GP5m-2A-IL-18、pZJ-IL-18的构建（3.1）pZJ-GP5-2A-M-2A-IL-18的构建：（3.1.1）EcoRI和XbaI双酶切GP5，XbaI和SphI双酶切G-2A-M，EcoRI和SphI双酶pMD18-T载体，回收酶切后的GP5、2A-M和pMD18-T，T4DNA连接酶作用下进行连接反应，之后进行质粒转化，菌液PCR筛选阳性克隆，将与阳性克隆相对的菌液进行扩大培养，提取质粒，该质粒命名为pMD-GP5-2A-M；（3.1.2）EcoRI和SphI双酶切pMD-GP5-2A-M，SphI和BamHI双酶切2A-IL-18，EcoRI和BamHI双酶切pZJ-1载体，回收酶切后的GP5-2A-M、2A-IL-18和pZJ-1，T4DNA连接酶作用下进行连接反应，之后进行质粒转化，菌液PCR筛选阳性克隆，将与阳性克隆相对的菌液进行扩大培养，提取质粒，该质粒命名为pZJ-GP5-2A-M-2A-IL-18；（3.2）pZJ-GP5-2A-M的构建：（3.2.1）EcoRI和XbaI双酶切GP5，XbaI和BamHI双酶切D-2A-M，EcoRI和SphI双酶切pMD18-T载体，回收酶切后的GP5、2A-M和pMD18-T，T4DNA连接酶作用下进行连接反应，之后进行质粒转化，菌液PCR筛选阳性克隆，将与阳性克隆相对的菌液进行扩大培养，提取质粒，该质粒命名为pMD-GP5-2A-M；（3.2.2）EcoRI和BamHI双酶切pMD-GP5-2A-M，EcoRI和BamHI双酶切pZJ-1载体，回收酶切后的GP5-2A-M和pZJ-1，T4DNA连接酶作用下进行连接反应，之后进行质粒转化，菌液PCR筛选阳性克隆，将与阳性克隆相对的菌液进行扩大培养，提取质粒，该质粒命名为pZJ-GP5-2A-M；（3.3）pZJ-GP5m-2A-IL-18的构建：（3.3.1）EcoRI和SphI双酶切G-GP5m，SphI和BamHI双酶切2A-IL-18，EcoRI和SphI双酶切pMD18-T载体，回收酶切后的GP5m、2A-IL-18和pMD18-T，T4DNA连接酶作用下进行连接反应，之后进行质粒转化，菌液PCR筛选阳性克隆，将与阳性克隆相对的菌液进行扩大培养，提取质粒，该质粒命名为pMD-GP5m-2A-IL-18；（3.3.2）EcoRI和BamHI双酶切pMD-GP5m-2A-IL-18，EcoRI和BamHI双酶切pZJ-1载体，回收酶切后的GP5m-2A-IL-18和pZJ-1，T4DNA连接酶作用下进行连接反应，之后进行质粒转化，菌液PCR筛选阳性克隆，将与阳性克隆相对的菌液进行扩大培养，提取质粒，该质粒命名为pZJ-GP5m-2A-IL-18；（3.4）pZJ-GP5m的构建：（3.4.1）EcoRI和BamHI双酶切D-GP5m，EcoRI和SphI双酶切pMD18-T载体，回收酶切后的GP5m和pMD18-T，T4DNA连接酶作用下进行连接反应，之后进行质粒转化，菌液PCR筛选阳性克隆，将与阳性克隆相对的菌液进行扩大培养，提取质粒，该质粒命名为pMD-GP5m；（3.4.2）EcoRI和BamHI双酶切pMD-GP5m，EcoRI和BamHI双酶切pZJ-1载体，回收酶切后的GP5m和pZJ-1载体，T4DNA连接酶作用下进行连接反应，之后进行质粒转化，菌液PCR筛选阳性克隆，将与阳性克隆相对的菌液进行扩大培养，提取质粒，该质粒命名为pZJ-GP5m；（3.5）pZJ-IL-18的构建：（3.5.1）EcoRI和BamHI双酶切IL-18，EcoRI和SphI双酶切pMD18-T载体，回收酶切后的IL-18和pMD18-T，T4DNA连接酶作用下进行连接反应，之后进行质粒转化，菌液PCR筛选阳性克隆，将与阳性克隆相对的菌液...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈陆，石昂，常洪涛，王永生，王新卫，高冬生，王川庆，
申请(专利权)人：河南农业大学，
类型：发明
国别省市：河南,41
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