一种细胞珠蛋白-人源乳铁蛋白肽融合蛋白、基因及应用制造技术

技术编号:21107058 阅读:36 留言:0更新日期:2019-05-16 04:31
本发明专利技术公开了一种细胞珠蛋白‑人源乳铁蛋白肽的融合蛋白,其特征在于所述融合蛋白是由穿膜肽(TAT)、细胞株蛋白(Cytoglobin,CYGB)与人乳铁蛋白肽(human Lactoferricin,hLFcin)串联构成;利用TAT实现融合蛋白分泌到胞外,方便纯化;利用CYGB蛋白带动乳铁蛋白肽的表达,并减轻抗菌肽对宿主菌的抑制;CYGB的抗氧化性有利于增加抗菌肽的储存稳定性。本发明专利技术可实现规模化生产TAT‑CYGB‑hLFcin融合蛋白,避免了融合蛋白设计Linker的繁琐步骤,并利用融合蛋白稳定特性简化了纯化该融合蛋白的方法,该融合蛋白显示出了作为水产品保鲜剂添加剂应用于水产品保鲜的前景。

A Cytoglobin-Human Lactoferrin Peptide Fusion Protein, Gene and Application

The invention discloses a fusion protein of cytoglobin and human lactoferrin peptide, which is characterized in that the fusion protein is composed of a transmembrane peptide (TAT), a cell line protein (CYGB) and a human lactoferrin peptide (hLFcin); the fusion protein is secreted out of the cell by TAT to facilitate purification; and the surface of lactoferrin is driven by CYGB protein. The antioxidant activity of CYGB is beneficial to increase the storage stability of antimicrobial peptides. The invention can realize large-scale production of TAT CYGB hLFcin fusion protein, avoid the tedious steps of designing Linker fusion protein, and simplify the method of purifying the fusion protein by using the stability characteristics of the fusion protein. The fusion protein shows the prospect of being used as an additive of aquatic product preservative.

【技术实现步骤摘要】
一种细胞珠蛋白-人源乳铁蛋白肽融合蛋白、基因及应用
本专利技术属于生物
,具体涉及一种细胞珠蛋白-人乳铁蛋白肽融合蛋白、基因及其应用。
技术介绍
水产品在国人的日常生活饮食中已占有重要的位置,人们对水产品的喜食程度也进一步增强,确保其新鲜品质不仅是提升人们生活品质,更是人们饮食安全的保障。其中保质期长、柔软多汁、色泽鲜红、味道鲜美的水产品,深受消费者欢迎,日益成为水产品消费的主流。由于其在0-4℃加工、流通并不能完全抑制微生物的生长繁殖,水产品品质发生变化主要是由于其自身含有的大量细菌,如链球菌书、假单胞菌属、杆菌属等,导致其货架期短且色泽易变,妨碍其水产品制备及卫生安全。采取合适的保鲜方法延长水产品的货架期及保护色泽就成为推动水产品市场发展的关键。在水产品的加工过程中添加保鲜剂,是稳定冷鲜肉品质,延长货架期最为有效的手段。然而近年来,由于化学保鲜剂(如苯甲酸钠、对羟基苯钾酸酯、亚硫酸盐等)潜在致癌、致突变、致畸的可能性,加上新型化学合成保鲜剂开发越发艰难,使得天然保鲜剂(如含硫芳香油、抗菌肽等)越发受到人们的青睐。乳铁蛋白肽(Lactoferricin,LFcin)是一种新型抗菌肽,由胃蛋白酶作用乳铁蛋白N端释放的一段多肽,其几乎具备乳铁蛋白所有生物学活性,抗菌作用强,且源于哺乳动物,不含稀有氨基酸和外源化学成分,无毒性。人源乳铁蛋白肽(humanLactoferricin,hLFcin)人乳铁蛋白N端第18到40位氨基酸组成的一段多肽,由23个氨基酸组成,对大肠杆菌和白色念珠菌都有抗菌活性,在抑菌及防腐中应用广泛,是天然保鲜剂、畜禽饲料添加剂等良好的原料。细胞珠蛋白(cytoglobin,CYGB),最早在患有肝纤维化的脊椎动物肝星状细胞中发现,定位于染色体17q25的人CYGB基因含有4个外显子和3个内含子,编码190个氨基酸残基,分子量约21.4kDa。研究表明CYGB主要存在于细胞质中,具有抗炎、抗纤维化、抗癌等作用,能够很好的清除氧自由基和过氧化物酶活性的作用。研究还发现CYGB可在大肠杆菌表达系统中高效表达,可以显著降低产物对宿主毒性、且实现高产。细胞穿膜肽(cell-penetratingpeptide,CPP),又称为蛋白转导域或膜转导肽,是一种由20个或者更少氨基酸组成的能够穿透细胞膜的多肽,能够运载生物活性物质如肽、蛋白、反义核苷酸和脂质体等许多物质,一般来源于可穿透生物屏障的富含碱性氨基酸的多肽或蛋白质。在CPPs中,富含精氨酸的CPPs研究最广泛,如HIV-1中的TAT(101个AA)反式激活因子,TAT47-57是最短的CPPs之一,含有11个氨基酸,含有6个精氨酸残基和2个赖氨酸残基已证明通过TAT的N端连接的融合蛋白能够在体外转导几乎所有检测过的细胞类型。中国专利技术专利CN108794635A公开了一种牛乳铁蛋白肽-人溶菌酶融合蛋白、基因及其应用,它采用基因工程的方法构建牛乳铁蛋白肽-人溶菌酶融合重组质粒,然后在真核表达牛乳铁蛋白肽-人溶菌酶融合蛋白。然而由于溶菌酶与抗菌肽对基因工程宿主菌具有一定的细胞毒性,通常采用融合其他蛋白的形式进行表达,以减弱该细胞毒性。中国专利技术专CN108660147A一种一种利用HU蛋白带动乳铁蛋白肽的表达以及纯化的方法,它将组蛋白样蛋白HU与牛乳铁蛋白肽融合在大肠杆菌中表达,之后纯化融合蛋白。然而这两种方法所用的融合蛋白本身对最终的产品功能没有帮助,主要方便纯化。
技术实现思路
鉴于此,本专利技术针对上述的问题,提供了一种细胞珠蛋白-人乳铁蛋白肽融合蛋白及应用,融合蛋白属分泌型,无需经过裂解,融合蛋白即具备乳铁蛋白肽酶的抗菌活性、细胞株蛋白的抗氧化性,同时表现出更好的储存稳定性。本专利技术采用的技术方案是:一种细胞珠蛋白-人源乳铁蛋白肽融合蛋白,所述融合蛋白是由细胞株蛋白、人源乳铁蛋白肽串联构成。所述融合蛋白的氨基酸序列为SEQNO.1。所述细胞珠蛋白-人源乳铁蛋白肽融合蛋白编码基因,其核苷酸序列为SEQNO.2。进一步地,将所述细胞珠蛋白-人源乳铁蛋白肽融合蛋白应用于制备抗菌保鲜剂中。所述抗菌保鲜剂为水产品保鲜剂。与现有技术相比,本专利技术具有以下显著优点和有益效果:(1)通过融合表达融合蛋白减轻抗菌肽对宿主菌的抑制;CYGB的抗氧化特性有利于增加抗菌肽的储存稳定性,该融合蛋白4℃放置10d后抑菌抗菌(大肠杆菌,ATCC25922)活力下降3.6%,20d后抑菌抗菌活力下降6.5%,30d后抑菌抗菌活力下降10.4%。(2)大肠杆菌表达得到TAT-CYGB-hLFcin融合蛋白,属分泌型蛋白,无需经过裂解纯化,通过阳离子交换柱、凝胶过滤柱即可实现纯度95%以上的纯度,纯化方便。(3)融合表达产物比人乳铁蛋白肽抗菌作用更强、抗菌谱更广。(4)融合蛋白大肠杆菌制品对水产品具有保鲜作用,可延长水产品货架期至少6天。附图说明图1重组质粒的构建示意图。图2收集每个洗脱峰样品进行SDS-PAGE电泳图。图3融合蛋白WesternBlot分析图。图4TAT-CYGB-hLFcin融合蛋白的储存稳定性。图5TAT-CYGB-hLFcin融合蛋白经不同pH处理后对大肠杆菌(ATCC25922)抑菌活性。图6TAT-CYGB-hLFcin大肠杆菌制品对鲈鱼保鲜期间的菌落总数变化图。图7TAT-CYGB-hLFcin大肠杆菌制品对鲈鱼保鲜期间的TVB-N值的变化图。图8TAT-CYGB-hLFcin大肠杆菌制品对鲈鱼保鲜期间的感官评价分值的变化图。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术进行进一步描述,但本专利技术的保护范围并不仅限于此:实施例1TAT-CYGB-hLFcin在大肠杆菌中小量表达(1)细胞穿膜肽TAT(SEQNO.3)、细胞株蛋白Cytoglobin(SEQNO.4)、人源乳铁蛋白肽(SEQNO.5)依次串联构成细胞珠蛋白-人源乳铁蛋白肽杂合蛋白。通过密码子优化软件对TAT-CYGB-hLFcin杂合蛋白基因编码序列交由基因合成公司进行全基因合成。(2)设计全长拼接引物,通过限制性酶切位点NdeI和EcoRI将TAT-CYGB-hLFcin基因插入到表达载体pET32a(+)中(图1),通过酶切法和测序确认最终表达载体的准确性,最终分别转到大肠杆菌BL21表达菌株中,获得含TAT-CYGB-hLFcin融合蛋白的工程菌株。取100μL重组菌的菌液均匀涂布到LB平板上(含终浓度50ug/mL的硫酸卡那霉素、20ug/mL的氯霉素),之后倒置于37℃培养箱过夜。将通过PCR确认的阳性重组子TAT-CYGB-hLFcin在LB培养基中37℃培养24h作为种子培养液。(3)将种子液以10%(v/v)接种量接种到LB培养基中(含终浓度50ug/mL的硫酸卡那霉素、20ug/mL的氯霉素),待培养至OD600为0.8,向试管培养液中加入终浓度0.25mMIPTG,置于37℃诱导表达24h。实施例2TAT-CYGB-hLFcin融合蛋白的分离纯化(1)收集发酵全菌含上清液,离心获得上清液,经20mMTris-HCl(pH8.0)重悬并离心得到蛋白上清,通过阳离子交换(CMSepharoseFastFlow)层析、S-100分子筛层析和SephadexG-25凝胶过滤本文档来自技高网
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【技术保护点】
1.一种细胞珠蛋白‑人源乳铁蛋白肽融合蛋白,其特征在于所述融合蛋白是由细胞株蛋白、人源乳铁蛋白肽串联构成。

【技术特征摘要】
1.一种细胞珠蛋白-人源乳铁蛋白肽融合蛋白,其特征在于所述融合蛋白是由细胞株蛋白、人源乳铁蛋白肽串联构成。2.如权利要求1所述细胞珠蛋白-人源乳铁蛋白肽融合蛋白,其特征在于所述融合蛋白的氨基酸序列为SEQNO.1。3.一种如权利要求1所述细胞珠...

【专利技术属性】
技术研发人员:段训威肖桂清杨槟煌陈洪彬董乐戴聪杰袁建军
申请(专利权)人:泉州师范学院
类型:发明
国别省市:福建,35

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