全人源PD-L1单克隆抗体及其制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及生物医药工程技术领域，公开了一种全人源PD‑L1单克隆抗体及其制备方法，并对其生物学活性鉴定。本发明专利技术提供的全人源抗体是从已构建的全人源高通量合成型噬菌体展示文库中筛选出的，免疫原性低，且能够特异结合于胞外区PD‑L1蛋白，阻断PD1与PD‑L1的结合，恢复T细胞的功能。可作为免疫检查点抑制剂，为治疗PD‑L1阳性的癌症提供有效的手段。

Human Monoclonal Antibody Against PD-L1 and Its Preparation and Application

The invention relates to the field of Biomedical Engineering technology, and discloses a full-human PD_L1 monoclonal antibody and its preparation method, and identifies its biological activity. The human antibody provided by the invention is screened from the constructed human high throughput synthetic bacteriophage display library, has low immunogenicity, and can specifically bind to the extracellular domain PD_L1 protein, block the binding of PD1 to PD_L1, and restore the function of T cells. It can be used as an immunological checkpoint inhibitor to provide an effective means for the treatment of PD L1 positive cancers.

【技术实现步骤摘要】
全人源PD-L1单克隆抗体及其制备方法和应用
本专利技术属于生物医药工程
，具体涉及一种全人源PD-L1单克隆抗体及其制备方法和应用。
技术介绍
T细胞的活化是免疫系统发挥作用的重要步骤，不仅需要抗原递呈细胞(APC)所提供的第一信号，同时也受到共刺激信号(第二信号)的调节。共刺激信号是一类细胞表面的膜蛋白，起到协同调节T细胞增殖、活化及分化的作用。程序性死亡因子1配体1(programmeddeath1ligand1，PD-L1)又称CD274，为B7家族成员，是PD-1的配体。PD-L1属于I型跨膜蛋白，共290个氨基酸，包含1个IgV样区、1个IgC样区、1个跨膜疏水区和1个由30个氨基酸组成的胞内区。与其他B7家族分子不同的是，PD-L1具有负向调节免疫应答的作用。研究发现，PD-L1主要表达于活化的T细胞、B细胞、巨噬细胞和树突状细胞等，除淋巴细胞外，PD-L1也表达于其他多种组织如胸腺、心脏、胎盘等的内皮细胞，以及各类非淋巴系如黑色素瘤、肝癌、胃癌、肾细胞癌、卵巢癌、结肠癌、乳腺癌、食道癌、头颈癌等。PD-L1在调节自身反应性T、B细胞和免疫耐受方面具有一定广泛性，并且在外周组织T和B细胞应答中起作用。PD-L1在肿瘤细胞上的高表达与癌症患者的不良预后相关。与PD-L1相结合的程序性死亡因子1(programmeddeath-1，PD-1)又称CD279，是CD28家族成员，其胞质区含有2个酪氨酸残基，靠近N端的1个位于免疫受体酪氨酸抑制基序(immunoreceptortyrosine-basedinhibitorymotif，ITIM)中，靠近C端的1个位于免疫受体酪氨酸转化基序(immunoreceptortyrosine-basedswitchmotif，ITSM)中。PD-1主要表达在活化的T淋巴细胞、B淋巴细胞和巨噬细胞表面。在正常情况下，PD-1能够抑制T淋巴细胞的功能，促进Treg的功能，从而抑制自身免疫应答，防止自身免疫性疾病的发生。但在肿瘤的发生中，肿瘤细胞表达的PD-L1与PD-1结合后却能通过对淋巴细胞的抑制性作用促进肿瘤的免疫逃逸。PD-L1与PD-1的结合可导致多种生物学变化，引起免疫调控，如能够抑制淋巴细胞的增殖和活化、抑制CD4+T细胞向Th1和Th17细胞分化、抑制炎性细胞因子的释放等。噬菌体抗体库技术模拟了人类B细胞的分化成熟过程，首先通过分子生物学手段将人类抗体的重链和轻链可变区基因连接起来形成单链抗体(Single-chainvariablefragment,scFv)，插入噬菌体载体上，使单链抗体scFv展示在噬菌体表面，再用特定的抗原筛选出特异性的噬菌体抗体，并用大肠杆菌表达大量单链抗体。单克隆抗体在癌症的检测及生物靶向治疗方面成功的应用，引起了肿瘤治疗的变革。然而，传统的单抗(150kD)分子质量过大，难穿透组织，造成肿瘤区域的有效浓度较低，治疗效果不充分；传统的抗体具有很高的免疫原性，而改造的抗体很难达到原来的亲和力。此外，完全人源化的传统抗体开发周期长，生产成本高，稳定性不够等诸多因素限制其在临床中的应用及普及。PD-1/PD-L1免疫疗法是通过阻断二者间的相互作用来提高免疫应答，具有治疗多种类型肿瘤及感染性疾病的潜力。程序性死亡受体-1(programmeddeath-1，PD-1)是CD28超家族成员，为一种重要的免疫抑制分子，主要表达在激活的T细胞和B细胞上。PD-1与其配体PD-Ls(programmeddeath-1ligands，主要是PD-L1与PD-L2)结合能够抑制T细胞的增殖、活化和相关细胞因子的分泌，使机体免受自身免疫系统的攻击。但在机体的肿瘤微环境中，肿瘤细胞高表达PD-L1，与T细胞上的PD-1发生结合后，诱导T细胞的衰竭，抑制T细胞的功能，无法有效激活免疫系统，引起肿瘤细胞的免疫逃逸。而针对PD-1、PD-L1的单克隆抗体可以阻断PD-1和PD-L1的结合，使T细胞恢复活力，从而增强免疫应答。目前，多株抗PD-1和PD-L1的抗体已上市，用于多种肿瘤的治疗，如Nivolumab(抗PD-1抗体)、Keytruda(抗PD-L1抗体)等。罗氏(Roche)公司的Atezolizumab(商品名Tecentriq)的作用靶点为PD-L1，2016年5月19日FDA提前四个月批准其作为二线药物用于治疗一种叫做urothelialcarcinoma的最常见晚期膀胱癌，被认为是最有前途的新一代免疫疗法之一。阿斯利康(AstraZeneca)针对PD-L1靶点的免疫疗法药物Imfinzi(Durvalumab)，近期在一项非小细胞肺癌(NSCLC)的3期和非小细胞肺癌(NSCLC)的3期临床试验中取得了突破性的进展。研究人员表示，抗PD-L1药物比抗PD-1药物具有更高的选择性，并可能减少肺脏及其他器官的炎症。本专利技术以重组人PD-L1胞外区蛋白为抗原，通过噬菌体展示文库的筛选和亲和力成熟后，制备得到高亲和力的抗PD-1特异性单克隆抗体，并通过体内外实验验证其高效生物学活性。
技术实现思路
本专利技术的首要目的在于提供一种新的氨基酸序列的全人源抗人PD-L1单克隆抗体，编码该单克隆抗体的核苷酸的载体、宿主细胞及其用途。本专利技术涉及的抗体基因可变区的序列，可构建全长抗体分子，作为药物用于临床上发挥抑制肿瘤细胞增殖的作用。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案是：首先构建抗原PD-L1表达载体pcDNA-hPD-L1-His，将重组质粒瞬时转染FreeStyleTM293细胞，培养五天后将细胞上清通过镍柱进行纯化，得到纯化的蛋白即抗原人PD-L1-His。采用Kabat数据库CDR区分类方法进行6个CDR分类，统计各CDR中氨基酸出现频率，剔除结构保守的loop和远离结合区域的氨基酸，挑CDR上氨基酸残基在数据库中出现频率低的用于序列随机化，放弃氨基酸出现频率较高的残基；通过CDR长度信息统计，确定各类CDR的长度多样性。每个突变位点使用NWG,NWC和NSG(N＝A,T,G或C；W＝A或T；S＝G或C)简并密码子。产生了14种具有长度多样性和序列多样性的CDR引物库，其中CDR-L1,L2,L3,H1和H2多样性介于105-107；长度多样性为6-10aa，11-14aa的CDR3-H3引物库序列多样性介于108-1012，采用高通量芯片基因合成方法合成，引物库包含用于PCR扩增的框架区和多样化的CDR区域。PCR扩增重链及轻链的可变区。然后进行人源VH和VL的单链抗体库的构建，构建步骤是先将CDR-L1和CDR-L2通过扩增延伸和PstI/MluI单一酶切位点克隆入pC3XK-VK-Bla载体，构建成为pC3XK-VK-CDR1-CDR2-Bla载体，扩增延伸CDR3和BpiI/HindIII酶切位点克隆入pC3XK-VK-CDR1-CDR2-Bla载体，构建成为pC3XK-VK-Bla-Lib。利用同样的方法构建pC3XK-VH-Bla-Lib。将VK-Lib用SacI和HindIII酶切位点克隆入pC3XF-scfv载体，构建成为pC3XFSS-VK-lib载体，再将VH-Lib用BamHI和SalI酶切位点克隆入pC本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种全人源PD‑L1单克隆抗体，其特征在于：包含轻链LCDR1、LCDR2、LCDR3和重链HCDR1、HCDR2、HCDR3；所述轻链LCDR1序列是RASQTVIGX1YLA(SEQ ID NO：1)或与其具有至少80％序列同一性的同源序列；所述轻链LCDR2序列是FGTSFRAT(SEQ ID NO：2)或与其具有至少80％序列同一性的同源序列；所述轻链LCDR3序列是LQX2QGFPX3T(SEQ ID NO：3)或与其具有至少80％序列同一性的同源序列；所述重链HCDR1序列是SGFTFDX4YWMH(SEQ ID NO：4)或与其具有至少80％序列同一性的同源序列；所述重链HCDR2序列是X5IX6DX7GGX8TX9YADSVKS(SEQ ID NO：5)或与其具有至少80％序列同一性的同源序列；所述重链HCDR3序列是SQDLAY(SEQ ID NO：6)或与其具有至少80％序列同一性的同源序列；其中X1是S或R；X2是T或R；X3是Y或L；X4是R或E；X5是T或S；X6是D或T；X7是S或T；X8是E或V；X9是N或H。

【技术特征摘要】
1.一种全人源PD-L1单克隆抗体，其特征在于：包含轻链LCDR1、LCDR2、LCDR3和重链HCDR1、HCDR2、HCDR3；所述轻链LCDR1序列是RASQTVIGX1YLA(SEQIDNO：1)或与其具有至少80％序列同一性的同源序列；所述轻链LCDR2序列是FGTSFRAT(SEQIDNO：2)或与其具有至少80％序列同一性的同源序列；所述轻链LCDR3序列是LQX2QGFPX3T(SEQIDNO：3)或与其具有至少80％序列同一性的同源序列；所述重链HCDR1序列是SGFTFDX4YWMH(SEQIDNO：4)或与其具有至少80％序列同一性的同源序列；所述重链HCDR2序列是X5IX6DX7GGX8TX9YADSVKS(SEQIDNO：5)或与其具有至少80％序列同一性的同源序列；所述重链HCDR3序列是SQDLAY(SEQIDNO：6)或与其具有至少80％序列同一性的同源序列；其中X1是S或R；X2是T或R；X3是Y或L；X4是R或E；X5是T或S；X6是D或T；X7是S或T；X8是E或V；X9是N或H。2.一种如要求1所述的全人源PD-L1单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)构建噬菌体展示文库：通过检索数据库人源和鼠源的抗体基因序列，比较分析抗体骨架序列和CDR区在人类抗体库中的出现频率和偏向性，确定了构建抗体库的germline基因和CDR区，其中，CDR区使用简并密码子进行了长度多样性和序列多样性设计，全部轻链CDR基因库和重链的CDR1及CDR2基因采用亚磷酰胺三酯基因合成方法合成，重链CDR3基因采用高通量芯片基因合成方法合成；(2)PD-L1的表达纯化：构建含有PD-L1-ECD序列(GenBankAccession:AY714...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐婷，周伟，崔智强，叶洪涛，鲍文英，杨文静，宋玉，范清林，宋礼华，
申请(专利权)人：安徽安科生物工程集团股份有限公司，
类型：发明
国别省市：安徽,34