一种无毒性的产气荚膜梭菌重组ε毒素和α毒素融合蛋白疫苗及其生产方法技术

本发明专利技术涉及一种无毒性的产气荚膜梭菌重组ε毒素和α毒素融合蛋白疫苗及其生产方法。该疫苗含有的无毒性产气荚膜梭菌ETX突变体和CPA的C末端融合蛋白rETXm3CPAC是通过将无毒性的ETX突变体ETXm3和CPA的C末端(CPAC)进行串联，并在大肠杆菌BL21(DE3)中实现可溶性表达，既可最大限度地保留天然毒素蛋白的空间构象，从而保持其免疫原性；又避免了包涵体变性复性的繁琐工艺对抗原蛋白免疫原性的影响，减少了疫苗的制备时间和生产成本。在rETXm3CPAC的C端含有6个组氨酸(6*His)标签，便于蛋白的纯化；获得的毒素融合蛋白在小鼠体内完全无毒，且在家兔模型中呈现良好的安全性、免疫原性和免疫保护性。疫苗还具有制备工艺简单，疫苗效力优良、同时预防A和D型产气荚膜梭菌病。

A non-toxic Clostridium perfringens recombinant fusion protein vaccine of epsilon toxin and alpha toxin and its production method

The invention relates to a non-toxic recombinant E toxin and a toxin fusion protein vaccine of Clostridium perfringens and a production method thereof. The vaccine contains a non-toxic ETX mutant of Clostridium perfringens and a C-terminal fusion protein of C PA, rETXm3 CPAC, which is a non-toxic ETX mutant of ETXm3 and CPA. It can be expressed Solubly in E. coli BL21 (DE3). It can not only retain the spatial conformation of natural toxin protein to the maximum extent, but also avoid the degeneration of inclusion bodies. The complex process of refolding has an effect on the immunogenicity of antigen protein, which reduces the preparation time and production cost of vaccine. The C-terminal of rETXm3CPAC contains six histidine (6*His) tags, which facilitate the purification of the protein. The obtained toxin fusion protein is completely non-toxic in mice, and presents good safety, immunogenicity and immunoprotection in rabbit model. The vaccine also has the advantages of simple preparation process, good vaccine efficacy and prevention of Clostridium perfringens type A and D.

【技术实现步骤摘要】
一种无毒性的产气荚膜梭菌重组ε毒素和α毒素融合蛋白疫苗及其生产方法
本专利技术涉及一种无毒性的产气荚膜梭菌重组ε毒素和α毒素融合蛋白疫苗及其生产方法。属于兽用生物制品领域。
技术介绍
产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringeris)是一种重要的人畜共患菌，能引起创伤性气性坏疽和人类食物中毒以及羊猝疽、羔羊痢疾、牛羊坏死性肠炎、牛羊肠毒血症，不仅威胁着人类的健康，而且对畜牧业造成了巨大的经济损失。由于产气荚膜梭菌病具有发病急、病程短且死亡率极高的特点，一旦发病，往往还来不及治疗就因外毒素中毒而发生猝死，因此免疫接种是防控该病的有效方法(陆承平.兽医微生物学[M].北京:中国农业出版社，2013:194-196.)。目前，使用的商品化梭菌疫苗主要是灭活疫苗，该类疫苗在预防动物产气荚膜梭菌方面虽然取得了一定的效果，但这些疫苗在使用过程中仍然暴露了一些缺陷，例如疫苗免疫易引起动物局部炎症及毒性反应等；其在制备过程中涉及外毒素的灭活，存在毒素外泄或灭活不彻底等生物安全隐患；此外，培养上清中的各种微小毒素以及细菌的代谢产物往往成为免疫动物的致敏原，接种动物易产生不良反应，导致免疫效果下降甚至免疫失败。因此，开发安全性好、有效抗原含量高、免疫原性强的产气荚膜梭菌毒素基因工程疫苗，是未来的发展方向。产气荚膜梭菌主要的致病因素是其分泌的外毒素。但目前为止，已发现的外毒素至少有20种，但以α(CPA)、β(CPB)、ε(ETX)和ι(CPI)这4种外毒素最为主要，并可据此将该菌分为A，B，C，D，E5个毒素型(Revitt-Mills,S；Rood,J；Adams,V.Clostridiumperfringensextracellulartoxinsandenzymes:20andcounting.Microbiol.Aust.2015,36,114–117.)。CPA是由产气荚膜梭菌染色体基因plc编码，plc存在于五个毒素型的菌株，但在A型毒株中表达水平最高。成熟的CPA由370个氨基酸构成，分为N-末端(1-246，CPAN)和C-末端(247-370，CPAC)两个结构域。其中，CPAN是CPA发挥酶活性的主要区域，而CPAC是毒素与细胞结合的主要区域。研究表明，重组CPA仍存在一定的毒力，而通过甲醛灭活后的天然毒素抗原性会明显降低(Byrne,M.P；Smith,L.A.Developmentofvaccinesforpreventionofbotulism.Biochimie2000,82,955-966)。为此，研制无毒力的重组CPA具有重要的意义。已有的研究表明，CPA的无毒区域CPAC能够对天然CPA起到良好的免疫保护作用，但由于CPAC蛋白分子量较小，研究者通常选择将CPAC与GST等大分子量标签蛋白融合表达，从而引入了过多无关的抗原成分。ETX主要是由B型和D型产气荚膜梭菌产生，是该类菌分泌的毒力最强的外毒素(LiJH,AdamsV,BannamTL,MiyamotoK,GarciaJP,UzalFA,RoodJL,McClaneaBA.Toxinplasmidsofclostridiumperfringens,MicrobiologyandMolecularBiologyReviews,2013,77(2):208-233.)。本课题组前期申请的专利“一种产气荚膜梭菌ε毒素重组亚单位疫苗及其生产方法”(专利申请号：201710981955.8)获得了含有3个氨基酸突变(第30位酪氨酸突变为丙氨酸，第106位组氨酸突变为脯氨酸，以及第196位酪氨酸突变为丙氨酸)的、无毒力的、免疫原性优良的重组ETX突变体，rETXY30A-H106P-Y196A(rETXm3)。
技术实现思路
本专利技术目的在于采用经过基因工程技术制备无毒性的产气荚膜梭菌重组ε毒素和α毒素融合蛋白疫苗，要求该疫苗一方面最大限度地保留ETX的完整性和空间构象，从而保持其免疫原性，又避免了单个氨基酸突变带来的生物安全隐患；另一方面选用抗原性优良的CPA无毒区域CPAC，避免了CPA的生物安全隐患。同时，该疫苗还具有制备工艺简单、免疫剂量低、免疫效力好等优点，用于预防由A型和D型产气荚膜梭菌引起的疾病。本专利技术技术方案1.一种无毒性的产气荚膜梭菌ε毒素和α毒素融合蛋白疫苗，其特征在于所述疫苗含有采用大肠埃希氏菌表达的产气荚膜梭菌ε毒素(ETX)突变体(rETXm3)和产气荚膜梭菌α毒素(CPA)C末端(CPAC)的毒素融合蛋白；制苗用菌种为重组表达毒素融合蛋白rETXm3CPAC的大肠埃希氏菌，被命名为大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)BL13株，该菌株已于2018年01月18日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCCNo.15237；所述表达的rETXm3CPAC与野生型ETX成熟毒素相比，包含多个氨基酸的突变；与野生型CPA成熟毒素相比，只含有毒素的无毒区域C末端；在毒素融合蛋白C端含有便于蛋白的纯化的标签。2.本专利技术所述疫苗，其特征在于rETXm3CPAC与野生型产气荚膜梭菌ETX成熟毒素相比，含有3个氨基酸突变，分别为第30位酪氨酸突变为丙氨酸，第106位组氨酸突变为脯氨酸，以及第196位酪氨酸突变为丙氨酸；与野生型CPA成熟毒素相比，只含有其无毒区域C末端(第247～370位氨基酸)。3.本专利技术所述疫苗，其特征在于rETXm3CPAC的编码基因序列经过密码子优化，更易于在大肠杆菌中实现高表达。4.本专利技术所述疫苗，其特征在于rETXm3CPAC没有毒力，大大降低了疫苗生产过程中的生物安全风险。5.本专利技术所述疫苗，其特征在于rETXm3CPAC在大肠杆菌BL21(DE3)中可以实现可溶性表达，既可最大限度地保留天然毒素蛋白的空间构象，从而保持其免疫原性；又避免了包涵体变性复性的繁琐工艺对抗原蛋白免疫原性的影响，减少了疫苗的制备时间和生产成本。6.本专利技术所述疫苗，其特征在于所述氨基酸标签，为在rETXm3CPAC的C端含有6个组氨酸(6*His)标签，便于蛋白的纯化。7.本专利技术所述疫苗，其特征在于该疫苗是用所述表达rETXm3CPAC的大肠埃希氏菌BLC13株作为疫苗生产菌株，经发酵培养、诱导表达、菌体破碎、可溶性抗原蛋白分离纯化后，加双相油佐剂混合制成。本专利技术的有益效果本专利技术涉及一种无毒性的产气荚膜梭菌重组ε毒素和α毒素融合蛋白疫苗及其生产方法。该疫苗含有的ETX突变体和CPAC的毒素融合蛋白，rETXm3CPAC，是通过将无毒性ETX突变体ETXm3和CPA的C末端(CPAC)进行串联，并在大肠杆菌BL21(DE3)中实现可溶性表达，既可最大限度地保留天然毒素蛋白的空间构象，从而保持其免疫原性；又避免了包涵体变性复性的繁琐工艺对抗原蛋白免疫原性的影响，减少了疫苗的制备时间和生产成本。rETXm3CPAC的C端含有6个组氨酸(6*His)标签，便于蛋白的纯化；获得的毒素融合蛋白在小鼠体内完全无毒，且在家兔模型中呈现良好的安全性、免疫原性和免疫保护性。此外，本专利技术进一步公开了含有所述毒素融合蛋白编码基因的重组表达载体和宿主本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种无毒性的产气荚膜梭菌ε毒素和α毒素融合蛋白疫苗，其特征在于所述疫苗含有采用大肠埃希氏菌表达的产气荚膜梭菌ε毒素(ETX)多氨基酸位点突变体和产气荚膜梭菌α毒素(CPA)C末端(CPAC)的毒素融合蛋白；制苗用菌种为表达重组毒素融合蛋白的大肠埃希氏菌，被命名为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)BL13株，该菌株已于2018年01月18日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCC No.15237；所述表达的无毒性的产气荚膜梭菌ε毒素和α毒素融合蛋白与野生型产气荚膜梭菌ε毒素成熟毒素相比，包含多个氨基酸的突变以及在C端添加便于蛋白的纯化的标签。

【技术特征摘要】
1.一种无毒性的产气荚膜梭菌ε毒素和α毒素融合蛋白疫苗，其特征在于所述疫苗含有采用大肠埃希氏菌表达的产气荚膜梭菌ε毒素(ETX)多氨基酸位点突变体和产气荚膜梭菌α毒素(CPA)C末端(CPAC)的毒素融合蛋白；制苗用菌种为表达重组毒素融合蛋白的大肠埃希氏菌，被命名为大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)BL13株，该菌株已于2018年01月18日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCCNo.15237；所述表达的无毒性的产气荚膜梭菌ε毒素和α毒素融合蛋白与野生型产气荚膜梭菌ε毒素成熟毒素相比，包含多个氨基酸的突变以及在C端添加便于蛋白的纯化的标签。2.如权利要求1所述一种无毒性的产气荚膜梭菌ε毒素和α毒素融合蛋白疫苗，其特征在于所述重组毒素融合蛋白，与野生型ETX成熟毒素相比，包含多个氨基酸的突变，为以下3个氨基酸突变，分别为第30位酪氨酸突变为丙氨酸，第106位组氨酸突变为脯氨酸，以及第196位酪氨酸突变为丙氨酸；与野生型CPA成熟毒素相比，只含有其无毒区域C末端(第247～370位氨基酸)。3.如权...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘莹，陈小云，杜吉革，薛麒，朱真，王磊，张莹辉，印春生，李启红，姚文生，康凯，
申请(专利权)人：中国兽医药品监察所，
类型：发明
国别省市：北京,11