玉米Zm-APX基因分子标记、获得方法及在弯孢叶斑病防治中的应用技术

本发明专利技术属于玉米抗性基因技术领域，具体涉及一种玉米Zm‑APX基因分子标记、获得方法及在弯孢叶斑病防治中的应用。提供了一种能够鉴定玉米弯孢叶斑病的分子标记及其获得方法，所述分子标记为如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.10所示的Zm‑APX基因。还提供了一种利用所述分子标记构建转基因玉米植株，并用于放防治玉米弯孢叶斑病的方法。通过检测Zm‑APX转基因材料并鉴定其弯孢叶斑病抗病性，发现Zm‑APX基因可提高玉米对弯孢叶斑病的抗性，为玉米弯孢叶斑病的抗病性育种提供了基因资源。

Molecular Markers of Zm-APX Gene in Maize and Its Application in Curvularia Leaf Spot Control

The invention belongs to the technical field of maize resistance gene, in particular to a molecular marker of maize Zm APX gene, a method for obtaining the molecular marker and its application in Curvularia leaf spot control. A molecular marker capable of identifying Curvularia leaf spot in maize and a method for obtaining the molecular marker are Zm_APX gene as shown in SEQ ID NO.1 or SEQ ID NO.10. A method for constructing transgenic maize plants by using the molecular markers is also provided and used for radiological control of Curvularia leaf spot of maize. It was found that Zm APX gene could improve the resistance of Maize to Curvularia leaf spot by detecting Zm APX transgenic materials and identifying their resistance to Curvularia leaf spot, which provided genetic resources for the breeding of resistance to Curvularia leaf spot.

【技术实现步骤摘要】
玉米Zm-APX基因分子标记、获得方法及在弯孢叶斑病防治中的应用
本专利技术属于玉米抗性基因
，具体涉及一种玉米Zm-APX基因分子标记、获得方法及在弯孢叶斑病防治中的应用。
技术介绍
玉米是世界上最为广泛栽培的粮食作物之一。一方面，玉米为人类和动物提供了大量的食物来源，但另一方面，玉米病害的发生可导致巨大的经济损失。尤其是近年来玉米病害发生日益频繁，病害种类日益增多，严重影响了玉米产业的发展。化学农药的使用在一定程度上提高了对玉米病害的控制作用，但是农药的使用不仅污染了环境，长期使用还会使玉米产生耐药性，同时，造成的药物残留对人类的生命安全也有潜在的威胁。因此，在对玉米抗病的研究中，人们致力于寻找既不影响环境又对玉米病害能够有效防治的方法。玉米弯孢叶斑病又称拟眼斑病、黑霉病，该病害在我国主要是由新月弯孢(Curvularialunata)引起。玉米弯孢叶斑病是典型的叶部病害，致病菌通过在病残体、秸秆上过冬，病原菌借助风、水、机械及昆虫等进行传播，引起植株发病。自上世纪80年代，随着我国栽培制度和气候的变化，该病害在我国个玉米主产区逐步流行，并引起过严重的产量损失。尽管近年来由于推广抗性品种，该病害得到一定控制，但由于该病原菌存在着明显的致病力分化现象，且我国玉米种质资源遗传基础狭窄，抗性资源趋同性严重，因此再次爆发该病害的风险性较大。特定基因是鉴定植物抗性的有效手段，但是目前尚未发现可以有效鉴定玉米弯孢叶斑病的抗性基因，限制了玉米品种的改良。因此，挖掘新的玉米弯孢叶斑病抗性基因，对玉米的遗传改良和生产具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术提供了一种玉米Zm-APX基因分子标记、获得方法及在弯孢叶斑病防治中的应用，提供了一种有效鉴定玉米弯孢叶斑病的抗性基因。本专利技术的第一个目的是提供一种能够鉴定玉米弯孢叶斑病的分子标记，所述分子标记为如SEQIDNO.1或SEQIDNO.10所示的Zm-APX基因。本专利技术的第二个目的是提供一种所述的能够鉴定玉米弯孢叶斑病的分子标记的获得方法，包括以下步骤：步骤1，提取玉米的总RNA备用；步骤2，将玉米总RNA反转录成cDNA第一链；步骤3，分子标记的克隆合成引物：Zm-APXF2:5'-TCCTTGCAACCCTCCGCCCTTTC-3'；Zm-APXR2:5'-TTGCCGAACCAACGGAAACTAG-3'；用步骤2反转录的cDNA第一链作为模板进行PCR扩增，PCR扩增体系如下：10×PCRBuffer4μl、10mMdNTP1μl、Zm-APXF20.5μl、Zm-APXR20.5μl、cDNA模板1.5μl、Taq酶0.5μl、灭菌H2O17μl；PCR结束后琼脂糖凝胶电泳，回收1186bp的条带，即获得能够鉴定玉米弯孢叶斑病的分子标记。本专利技术的第三个目的是提供一种所述的分子标记在玉米弯孢叶斑病防治中的应用。与现有技术相比，本专利技术提供的一种Zm-APX基因在玉米弯孢叶斑病防治中的应用至少具有以下有益效果：本专利技术通过检测Zm-APX转基因材料并鉴定其弯孢叶斑病抗病性，结果显示在转基因阳性株系中Zm-APX的表达量显著高于阴性株系。人工接种弯孢叶斑病后，在Zm-APX转基因阳性株系中病斑的显著小于阴性株系。结合转基因阳性株系和阴性株系的qRT-PCR结果我们可以发现Zm-APX基因可提高玉米对弯孢叶斑病的抗性，实验结果为进一步探究Zm-APX的功能奠定了一定的基础，同时也为玉米弯孢叶斑病的抗病性育种提供了基因资源。利用本专利技术提供的能够鉴定玉米弯孢叶斑病的分子标记Zm-APX基因可有效鉴定玉米品种是否抗病，也可构建转基因植株，以增加原玉米品种的弯孢叶斑病抗性，对玉米的遗传改良和生产具有重要意义。附图说明图1是本专利技术玉米总RNA和玉米18ScDNA第一链的电泳图；图1A是玉米总RNA，1、2泳道均是玉米总RNA；图1B是玉米18ScDNA第一链，M泳道为DL2000，1-4泳道均是玉米18ScDNA第一链；图2是Zm-APXF2、Zm-APXR2引物扩增和5个阳性克隆子的检测结果；图2A是Zm-APXF2、Zm-APXR2引物扩增结果，其中M号泳道是DL2000，1号泳道是扩增产物；图2B是5个阳性克隆子的检测结果，其中M号泳道是DL2000，1-5号泳道是阳性克隆子；图3是Zm-APXR5、Zm-APXF5引物PCR产物电泳结果；其中M号泳道是BM5000，1-2号泳道是PCR产物；图4是PMD-Zm-APX和质粒载体pCAMBIA3301的双酶切电泳结果；图4A是PMD-Zm-APX双酶切电泳结果,M号泳道是DL2000，1-2号泳道是PMD-Zm-APX双酶切产物；图4B是质粒载体pCAMBIA3301的双酶切电泳结果，M号泳道是DL150000，1-3号泳道是pCAMBIA3301的双酶切产物；图5是T2代转基因玉米植株PCR检测结果；M号泳道是DL50000，243、241号泳道是阴性株系，其余泳道是阳性株系；图6是转基因株系的实时荧光定量PCR检测结果；图7是转基因株系的表型鉴定结果；图7A、图7B、图7C、图7D分别是235、236、243、241转基因株系；图8是玉米弯孢叶斑病病斑的差异性进行数据统计分析。具体实施方式为了使本领域技术人员更好地理解本专利技术的技术方案能予以实施，下面结合具体实施例和附图对本专利技术作进一步说明。下面各实施例以及上述
技术实现思路
中未注明具体条件的试验方法，均按照本领域的常规方法和条件进行，所用的材料若无特殊说明均为市售。玉米自交系B73为河南农业大学农学院保存。大肠杆菌DH5α购自上海北诺生物科技有限公司，RNA提取试剂TRIZOLReagent，反转录试剂盒，琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒，T载体、PMD18-T载体，Taq酶，质粒提取试剂盒，限制性内切酶，T4连接酶，DEPC水均购自宝生物工程有限公司，测序和引物合成分别在华大和上海生工进行。玉米自交系B73取样方式如下：玉米自交系B73种植后，待四叶一心时取玉米叶片-80℃保存备用。实施例1一种所述Zm-APX基因的克隆方法，具体步骤如下：步骤1，采用RNA提取试剂TRIZOLReagent提取玉米自交系B73叶片的总RNA，获得玉米总RNA备用。用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1A所示，图1A中1、2泳道均是玉米总RNA，均包括28S、18S为核糖体的大、小两个亚基，最下面那条条带为5.8S和5S(因为长度差距不大，故5.8S和5S很难在电泳中区分出来)，说明RNA完整性良好，可以用作后续试验。步骤2，提取玉米基因组DNA用植物基因组DNA提取试剂盒(天根)提取玉米基因组DNA，备用。步骤3，cDNA第一链的合成和检测(1)cDNA第一链的合成按照反转录试剂盒的说明，将玉米总RNA反转录成cDNA第一链。cDNA第一链的合成体系为：步骤1的玉米总RNA6μl、Oligo(DT)1μl、DEPC水4μl。65℃温浴5min，然后冰上放置2min，再加入如下试剂：RNase抑制剂1μl、M-mlvbuffer4μl、dNTP(25nml)3μl、M-mlv反转录酶1μl；其中，Oligo(DT)的核苷酸序列如下：5’-d(TTTTTTTTTTTTTTTTTT)-3本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种能够鉴定玉米弯孢叶斑病的分子标记，其特征在于，所述分子标记为如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.10所示的Zm‑APX基因。

【技术特征摘要】
1.一种能够鉴定玉米弯孢叶斑病的分子标记，其特征在于，所述分子标记为如SEQIDNO.1或SEQIDNO.10所示的Zm-APX基因。2.一种权利要求1所述的能够鉴定玉米弯孢叶斑病的分子标记的获得方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1，提取玉米的总RNA备用；步骤2，将玉米总RNA反转录成cDNA第一链；步骤3，分子标记的克隆合成引物：Zm-APXF2:5'-TCCTTGCAACCCTCCGCCCTTTC-3'；Zm-APXR2:5'-TTGCCGAACCAACGGAAACTAG-3'；用步骤2反转录的cDNA第一链作为模板进行PCR扩增，PCR扩增体系如下：10×PCRBuffer4μl、10mMdNTP1μl、Zm-APXF20.5μl、Zm-APXR20.5μl、cDNA模板1.5μl、Taq酶0.5μl、灭菌H2O17μl；PCR结束后琼脂糖凝胶电泳，回收1186bp的条带，即获得能够鉴定玉米弯孢叶斑病的分子标记。3.根据权利要求2所述的能够鉴定玉米弯孢叶斑病的分子标记的获得方法，其特征在于，将回收1186bp的条带转化入大肠杆菌感受态细胞中，保存备用。4.根据权利要求1所述的分子标记在玉米弯孢叶斑病防治中的应用。5.根据权利要求4所述的分子标记在玉米弯孢叶斑病防治中的应用，其特征在于，利用所述分子标记Zm-APX基因构建能够稳定表达Zm-APX的过表达载体，然后将所述过表达载体转化入农杆菌感受态细胞中，得到转化菌，最后用所述转化菌转化玉米植株，获得具有玉米弯孢叶斑病抗性的阳性转基因株系。6.根据权利要求5所述的分子标记在玉米弯孢叶斑病防治中的应用，其特征在于，核苷酸序列如SEQIDNO.10所示的Zm-APX的过表达载体按照以下步骤构建：合成引物：Zm-APXR5：5'-ACCCATGGATGGCGAAGAACTAC-3'；Zm-APXF5：5'-ACAGA...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴刘记，王顺喜，陈赞，董永彬，
申请(专利权)人：河南农业大学，
类型：发明
国别省市：河南,41