一种利用细菌上清制备纳米金属氧化物的方法及其产品和应用技术

本发明专利技术公开了一种利用细菌上清制备金属氧化物纳米材料的方法，包括如下步骤：1)将多粘类芽孢杆菌于LB液体培养基中培养得到细菌培养液，离心取上清，再经过过滤得到无细胞上清；2)将得到的无细胞上清与金属氧化物溶液混合，于室温静置22～24h，离心、洗涤、真空冷冻干燥后得到金属氧化物纳米材料；所述金属氧化物为ZnO、MgO、MnO2中的任意一种。本发明专利技术方法合成方法简单快速、绿色环保、成本低，得到的纳米产品粒径小、分散性好，具有良好的抑菌效果，尤其是抑制水稻白叶枯病菌的能力很好，能够作为防治水稻白叶枯等重要植物病害的抑菌剂。

A Method for Preparing Nanometer Metal Oxides from Bacterial Supernatants and Its Products and Applications

The invention discloses a method for preparing metal oxide nanomaterials by using bacterial supernatant, which includes the following steps: 1) Bacillus polymyxa is cultured in LB liquid medium to obtain bacterial culture medium, centrifuged to take the supernatant, and then filtered to obtain acellular supernatant; 2) the acellular supernatant is mixed with metal oxide solution, and is placed at room temperature for 22-24 hours, centrifuged and washed. Metal oxide nanomaterials are obtained after vacuum freeze-drying, and the metal oxide is any of ZnO, MgO and MnO 2. The method has the advantages of simple, rapid, green, environmental protection, low cost, small particle size, good dispersion and good bacteriostasis effect, especially the ability to inhibit bacterial blight of rice, and can be used as a bacteriostatic agent for controlling important plant diseases such as bacterial blight of rice.

【技术实现步骤摘要】
一种利用细菌上清制备纳米金属氧化物的方法及其产品和应用
本专利技术涉及生物合成纳米材料领域，具体涉及一种利用芽孢杆菌上清制备纳米金属氧化物的方法及其应用。
技术介绍
细菌性叶枯病作为对世界水稻种植区最具破坏性的水稻病害之一，其造成的经济作物损失可高达50％的比重。当前尽管化学防治方法在控制病害发生、保证生产方面发挥着重要作用，但其对环境、消费者和细菌自身耐药性的发展有着潜在危害。当前用作金属杀菌剂的金属仅包括Cu、Ag、Zn。据已有报道，纳米ZnO作为一种广谱性杀菌材料，能够有效杀死大肠杆菌、金黄色葡萄球菌，对革兰氏阳性菌与阴性菌具有较强的抑菌作用，广泛应用于医学领域、涂料、包装等。因而，生态友好型和生物相容性好的纳米金属氧化物绿色合成技术及其可应用产品将成为研究热点，传统制备纳米金属抑菌剂主要通过物理、化学等方法，但物理方法对设备要求高，而化学方法采用的化学试剂又对环境和人体健康造成危害。近年来，人们开始尝试利用植物、微生物等生物体内蕴含的活性物质作为还原剂和稳定剂制备纳米金属抑菌剂。如专利申请文献CN107671305A公开了一种利用小叶女贞果实提取液快速制备纳米银抑菌剂的方法，专利申请文献CN106513707A公开了一种利用蓝莓叶提取液生物合成的纳米银抑菌剂及其的制备工艺，专利申请文献CN104355331A公开了一种利用黄蓍胶溶液制备单分散纳米ZnO的方法。与传统制备方法相比，生物合成法不需添加任何还原剂、价格低廉，反应条件温和、绿色环保，合成效率高、利于工业化放大。因此，纳米生物合成法成为纳米合成领域的新热点，随着科技的进步，未来合成纳米材料技术的生产将朝着低成本、低消耗、低污染发展，未来农业生产中水稻病害的防治也必定朝着可持续、安全、无污染方向发展。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供了一种利用多粘类芽孢杆菌上清制备纳米ZnO、纳米MgO和纳米MnO2的方法，该制备工艺绿色环保、可大规模生产，得到的纳米ZnO、纳米MgO和纳米MnO2均具有很好的抑菌效果，可作为水稻白叶枯抗菌剂使用。本专利技术的目的通过如下技术方案实现：一种利用细菌上清制备金属氧化物纳米材料的方法，包括如下步骤：(1)将多粘类芽孢杆菌于LB液体培养基中培养得到细菌培养液，离心取上清，再经过过滤得到无细胞上清；(2)将步骤(1)得到的无细胞上清与金属氧化物溶液混合，于室温静置22～24h，离心、洗涤、真空冷冻干燥后得到金属氧化物纳米材料；步骤(2)中，所述金属氧化物为ZnO、MgO、MnO2中的任意一种。本专利技术方法将多粘类芽孢杆菌上清与金属氧化物溶液混合，细菌培养液上清中蕴含的活性物质作为还原剂和稳定剂制备出纳米金属氧化物；此外，多粘类芽孢杆菌的培养液上清中富含的特定蛋白质、脂类、多糖等生物大分子，能够与纳米金属氧化物结合而赋予其独特的理化性状和生物学特性，使产物结构更加稳定，抑菌效果更显著、生物兼容性更好。步骤(1)中，所述LB液体培养基配方(1L)：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g，pH7.0，121℃灭菌20min。所述细菌最佳培养温度为20～40℃，优选为30℃，温度过高或者过低皆不适合细菌生长繁殖，从而影响其上清液成分；震荡速率150～250rpm/min，震荡速率在此范围内可以保证细菌菌体与培养基接触充分，提高生长效率。所述细菌培养液进行离心取上清过程中，转速为5000～8000rcf/min，离心时间3～5min，在此范围内离心较充分，可保证上清液中不含有细菌菌体，有利于后续生物合成纳米颗粒。上述过滤过程采用孔径不大于0.22μm的过滤器进行过滤，可以充分过滤掉细菌，从而得到无细胞的上清，有利于后续反应的进行。优选地，所述培养方法为：将多粘类芽孢杆菌单菌落接种于LB液体培养基中培养12～18h，将得到的菌液以1％～3％的接种量转移至的LB液体培养基中，震荡培养12～18h，得到细菌培养液。采用上述培养方法得到的细菌培养液中富含丰富的蛋白质、脂类、多糖等生物大分子，其经过离心、过滤后得到的无细胞上清可直接与金属氧化物溶液混合制备纳米材料，不仅简化了制备工艺，还能使产物结构更加稳定，提高产物的抑菌效果。步骤(1)得到的无细胞上清与金属氧化物溶液的质量比为1～2：1，所述金属氧化物溶液的浓度为0.1～1mM。金属氧化物溶液用量过高会影响制得的金属氧化物纳米材料的抑菌效果，而用量过低相当于降低原材料的投入量，会导致合成效率低。浓度过低不足以合成纳米颗粒，浓度过高则不仅影响产物结构的稳定性与合成效率且会造成原材料不必要的浪费。步骤(2)中，所述离心速率为8000～10000rcf/min，离心时间10～20min。离心速率过低、时间过短，会导致上清不够澄清，最终获得的纳米粉末含杂质；离心速率过高、时间过长则造成资源浪费。本专利技术还公开了根据上述方法制得的纳米ZnO、纳米MgO和纳米MnO2及其作为农用杀菌剂在防治水稻白叶枯病中的应用。具体应用方法为：将所述纳米ZnO、MgO、MnO2中任意一种溶于水制得浓度为4～8μg/ml溶液，再将溶液均匀喷施与可能爆发白叶枯病害的水稻苗上。若配制的抗菌剂浓度过低，对水稻白叶枯病菌不能产生较好的抑制效果，从而无法达到对水稻白叶枯病害进行有效防治；若抗菌剂浓度过高，则使水稻上残留过量的抗菌剂，造成不必要的浪费。本专利技术与现有技术相比，具有以下有益效果：(1)本专利技术的制备工艺简单、绿色环保、无需催化剂、成本低、能源消耗相对较少，十分适用于大规模生产；(2)本专利技术方法制得的纳米金属氧化物平均粒径小、分散性好、结构稳定、具有良好的生物兼容性；所制备的纳米金属氧化物均能够产生活性氧，通过与细胞膜充分接触和相互作用，使细胞膜损伤、内容物流失而导致细菌死亡，具有显著的抑菌效果，能够杀死绝大多数白叶枯病原物，将其应用于防治水稻白叶枯病中，不仅可以起到很好的防治效果，还减轻了传统化学杀菌剂对环境的负担，在农业生产领域中有广阔的应用和推广前景。附图说明图1为实施例1～3中利用细菌上清液制备纳米ZnO、纳米MgO、纳米MnO2的流程图；图2为实施例1～3中利用细菌上清液所制备纳米ZnO、纳米MgO、纳米MnO2的紫外可见(UV-Vis)吸收光谱图；图3为实施例1～3中利用细菌上清液所制备纳米ZnO、纳米MgO、纳米MnO2的FTIR图；图4为实施例1～3中利用细菌上清液所制备纳米ZnO、纳米MgO、纳米MnO2的XRD图；图5为实施例1～3中利用细菌上清液所制备纳米ZnO、纳米MgO、纳米MnO2的SEM-EDS显微照片谱图；图6为实施例1～3中利用细菌上清液所制备纳米ZnO、纳米MgO、纳米MnO2的TEM形貌特征图；图7为实施例1～3中利用细菌上清液所制备的不同浓度纳米ZnO、纳米MgO、纳米MnO2对水稻白叶枯病菌的生长、生物膜形成的影响；图8为实施例1～3中利用细菌上清液所制备的不同浓度纳米ZnO、纳米MgO、纳米MnO2对水稻白叶枯病菌生长密度的影响；图9为实施例1～3中利用细菌上清液制备浓度8μg/ml纳米ZnO、纳米MgO、纳米MnO2对水稻白叶枯病菌细胞壁破坏程度。具体实施方式下面结合具体实施例，进一步阐明本专利技术。下列实施例所用的多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspoly本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种利用细菌上清制备金属氧化物纳米材料的方法，包括如下步骤：(1)将多粘类芽孢杆菌于LB液体培养基中培养得到细菌培养液，离心取上清，再经过过滤得到无细胞上清；(2)将步骤(1)得到的无细胞上清与金属氧化物溶液混合，于室温静置22～24h，离心、洗涤、真空冷冻干燥后得到金属氧化物纳米材料；步骤(2)中，所述金属氧化物为ZnO、MgO、MnO2中的任意一种。

【技术特征摘要】
1.一种利用细菌上清制备金属氧化物纳米材料的方法，包括如下步骤：(1)将多粘类芽孢杆菌于LB液体培养基中培养得到细菌培养液，离心取上清，再经过过滤得到无细胞上清；(2)将步骤(1)得到的无细胞上清与金属氧化物溶液混合，于室温静置22～24h，离心、洗涤、真空冷冻干燥后得到金属氧化物纳米材料；步骤(2)中，所述金属氧化物为ZnO、MgO、MnO2中的任意一种。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，培养温度20～40℃，震荡速率150～250rpm/min。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的离心转速为5000～8000rcf/min，离心时间为3～5min。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，采用孔径不大于0.22μm的过滤器进行...

【专利技术属性】
技术研发人员：李斌，洪纤纤，张牧晨，刘柳，邱文，张阳，索拉·奥莱坦，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33