示踪猪GADD45a亚细胞定位的方法及用途技术

本发明专利技术公开了一种猪GADD45a荧光示踪表达载体的构建方法，包括以下步骤：根据pEGFP‑N1载体的信息和猪GADD45a全长基因序列设计并合成扩增GADD45a全长的引物Ⅰ，同时根据pEGFP‑N1载体上的XhoI酶切位点，设计含有载体末端15‑25bp同源臂的目的基因的引物Ⅱ；将扩增得到的基因片段割胶回收，然后与线性化的pEGFP‑N1载体同源重组，将同源重组产物转化大肠杆菌DH5α，经筛选、鉴定后，构建得到带绿色荧光报告基团的pEGFP‑GADD45a的重组质粒；其能用于研究示踪猪GADD45a在不同细胞中的定位。本发明专利技术开拓了目前研究猪GADD45a功能及其定位方面研究的新思路。

Method and application of tracing subcellular localization of porcine GADD45a *

The invention discloses a method for constructing porcine GADD45a fluorescent tracer expression vector, which comprises the following steps: designing and synthesizing primer I of GADD45a according to the information of pEGFP N1 N1 and the full-length gene sequence of pig GADD45a, and designing primer II containing target genes containing 15 terminal 25bp homologous arm at the end of the carrier, according to the XhoI enzyme cut site of pEGFP N1 N1, and amplifying it. The gene fragment was recovered by tapping and then homologous with the pEGFP N1 vector. The homologous recombinant product was transformed into Escherichia coli DH5 alpha. After screening and identification, a recombinant plasmid containing pEGFP GADD45a GADD45a with green fluorescence reporter group was constructed. It can be used to study the location of porcine GADD45a in different cells. The invention has opened up a new train of thought for studying the function and location of pig GADD45a at present.

【技术实现步骤摘要】
示踪猪GADD45a亚细胞定位的方法及用途
本专利技术涉及一种示踪猪GADD45a(growtharrestandDNAdamageinduciblealpha)亚细胞定位的方法建立及用途，属于生物和现代农业
的应用技术。
技术介绍
GADD45a(又叫DDIT1)是生长阻滞和DNA损伤诱导基因家族成员之一，参与调控细胞周期、细胞凋亡、细胞衰老和肿瘤发生发展等。在多种因素诱导的细胞应激及DNA损伤应答调控网络中发挥重要生物学功能，抑制细胞增殖、促进凋亡；还可以通过阻滞细胞周期、修复DNA损伤和促进细胞凋亡等途径减少细胞癌变的可能和肿瘤的发生。p53基因是一个广谱抑癌基因，参与细胞周期、细胞生长、细胞凋亡、DNA损伤和修复的调控，在基因调控网络中具有中枢地位。GADD45a是第一个被检出的p53的下游基因，是一个能够识别基因组损伤的重要生物标志物。也是BRCA1的下游基因。GADD45a可由UV放射、低氧、离子辐射、基因毒性药物等损伤因素快速诱导产生，可以通过p53依赖及非依赖两条途径被诱导表达增高，在调控细胞周期、维持基因组稳定性、细胞凋亡、DNA损伤修复以及信号传导等重要细胞生命活动中起重要作用。猪GADD45a基因的mRNA序列有1527bp，一共4个外显子，编码序列全长为498bp，编码165个氨基酸，编码约18kD的蛋白。但是，目前关于猪GADD45a的研究报道甚少，未见关于猪GADD45a亚细胞定位的相关研究。最近研究也发现，GADD45A可以调控脂肪细胞分化聚酯。在猪上，GADD45a可能与肌内脂肪沉积密切相关。因此，开展GADD45a亚细胞定位及其在糖脂代谢中的功能研究具有重要的意义。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种猪GADD45a亚细胞地位的研究方法建立，以及该方法的用途。为了解决上述技术问题，本专利技术提供一种猪GADD45a荧光示踪表达载体(pEGFP-GADD45a，即，带EGFP荧光报告基团的GADD45a表达载体)的构建方法，包括以下步骤：1)、根据pEGFP-N1载体的信息和猪GADD45a全长基因序列(靶序列)设计并合成扩增GADD45a全长的引物Ⅰ，同时根据pEGFP-N1载体上的XhoI酶切位点，设计含有载体末端15-25bp同源臂的目的基因(GADD45a基因)的引物Ⅱ；注：设计上述目的基因的下游引物时必须使目的基因与GFP在同一阅读框；2)、GADD45a荧光示踪表达载体(pEGFP-GADD45a)的构建：将利用含有载体末端15-25bp同源臂的GADD45a基因引物扩增得到的基因片段割胶回收，然后与线性化的pEGFP-N1载体同源重组，将同源重组产物转化大肠杆菌DH5α，经筛选(卡那霉素平板)、鉴定(PCR鉴定满足扩增条带大小约500bp；测序鉴定满足序列与猪GADD45a序列一致)后，构建得到带绿色荧光报告基团的pEGFP-GADD45a的重组质粒。即：全长序列克隆和同源重组：扩增出两端含同源臂的PCR产物，切胶回收。使用TreliefTMSoSooCloningKitVer.2试剂盒进行同源重组，构建pEGFP-GADD45a的重组质粒，转化大肠杆菌，并挑选单克隆测序验证。使用内切酶XhoI酶切载体pEGFP-N1，胶回收线性化载体。将扩增出两端含同源臂的PCR产物，切胶回收。将XhoI线性化载体和含同源臂的PCR产物同源重组，并转化大肠杆菌，抗性卡那霉素筛选，以线性化载体作空白对照。作为本专利技术的猪GADD45a荧光示踪表达载体(pEGFP-GADD45a)的构建方法的改进：引物Ⅰ(扩增GADD45a全长的引物)为：GADD45a-F：ATGACTTTGGAGGAATTCTCGGCGADD45a-R：TCACCGTTCAGGAAGATTAATCACTG引物Ⅱ(含有载体末端15-25bp同源臂的目的基因引物)为：XhoI-GADD45a-F：ctaccggactcagatctcgagccaccATGACTTTGGAGGAATTCTCGGXhoI-GADD45a-R：aattcgaagcttgagctcgagCCGTTCAGGAAGATTAATCACTGG。同源臂示意图如图3所述。作为本专利技术的猪GADD45a荧光示踪表达载体(pEGFP-GADD45a)的构建方法的进一步改进：所述步骤2)为：将pEGFP-N1质粒进行XhoI酶切线性化后，使用TreliefTMSoSooCloningKitVer.2试剂盒与含有同源臂的GADD45a基因引物PCR扩增产物进行同源重组，并采用热激转化大肠杆菌，得到pEGFP-GADD45a的重组质粒。作为本专利技术的猪GADD45a荧光示踪表达载体(pEGFP-GADD45a)的构建方法的进一步改进，步骤2)所得的表达载体进行鉴定：通过抗生素筛选，将阳性克隆采用PCR和测序鉴定；PCR反应的引物为GADD45a全长引物；测序引物为CMV-F和PEGFP-N3引物，分别为5’-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3’和5’-CGTCGCCGTCCAGCTCGACCAG-3’。即，本专利技术先将单克隆菌进行鉴定，挑取单克隆菌使用全长引物进行PCR验证，验证后进一步使用CMV-F与PEGFP-N3测序鉴定。本专利技术还同时提供了上述猪GADD45a荧光示踪表达载体(pEGFP-GADD45a)的用途：用于研究示踪猪GADD45a在不同细胞中的定位。作为本专利技术用途的改进：用于研究猪GADD45a在不同细胞种类中的亚细胞定位及其功能。具体而言：构建好的pEGFP-GADD45a转染到293T、IPEC-J2、猪脂肪细胞等不同的细胞后，通过免疫荧光检测技术可以较好的示踪猪GADD45a在不同细胞中的亚细胞定位。因此，可以用于研究GADD45a在不同细胞中的亚细胞定位、功能及相关调控研究。即，提取阳性克隆的质粒pEGFP-GADD45a，转染不同293T、IPEC-J2和猪脂肪前体细胞，荧光显微镜观察GADD45a亚细胞定位。作为本专利技术用途的进一步改进：包括以下步骤：(1)、将含猪pEGFP-GADD45a表达载体的大肠杆菌扩培后，提取高纯转染级质粒；(2)、将含猪pEGFP-GADD45a表达载体的高纯转染级质粒转染猪脂肪细胞、IPEC-J2等细胞，37℃，5％的CO2中保温4～6h后更换不含抗生素的培养基；(3)、转染48h后，分析GADD45a表达情况及其亚细胞定位，研究其亚细胞定位和功能调控等。本专利技术的示踪猪GADD45a亚细胞地位的方法建立及其用途，具有以下有益效果：本专利技术根据pEGFP-N1载体载体信息和靶序列设计并合成了含有载体末端15-25bp同源臂的目的基因扩增引物，割胶回收的到的扩增产物和线性化的pEGFP-N1载体同源重组后，转化大肠杆菌DH5α，经筛选和鉴定后，构建得到带绿色荧光报告基团的pEGFP-GADD45a的重组质粒。构建好的pEGFP-GADD45a可以较好的示踪猪GADD45a在不同细胞中的亚细胞定位。本专利技术是利用荧光报告基团标记技术示踪GADD45a的细胞定位，开拓了目前研究猪GADD45a功能及其定位方面研究的新思路。此法所得的pEGFP-GADD45a，构建方法简单、可行，具有较本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种猪GADD45a荧光示踪表达载体的构建方法，其特征是包括以下步骤：1)、根据pEGFP‑N1载体的信息和猪GADD45a全长基因序列设计并合成扩增GADD45a全长的引物Ⅰ，同时根据pEGFP‑N1载体上的XhoI酶切位点，设计含有载体末端15‑25bp同源臂的目的基因的引物Ⅱ；2)、GADD45a荧光示踪表达载体的构建：将利用含有载体末端15‑25bp同源臂的GADD45a基因引物扩增得到的基因片段割胶回收，然后与线性化的pEGFP‑N1载体同源重组，将同源重组产物转化大肠杆菌DH5α，经筛选、鉴定后，构建得到带绿色荧光报告基团的pEGFP‑GADD45a的重组质粒。

【技术特征摘要】
1.一种猪GADD45a荧光示踪表达载体的构建方法，其特征是包括以下步骤：1)、根据pEGFP-N1载体的信息和猪GADD45a全长基因序列设计并合成扩增GADD45a全长的引物Ⅰ，同时根据pEGFP-N1载体上的XhoI酶切位点，设计含有载体末端15-25bp同源臂的目的基因的引物Ⅱ；2)、GADD45a荧光示踪表达载体的构建：将利用含有载体末端15-25bp同源臂的GADD45a基因引物扩增得到的基因片段割胶回收，然后与线性化的pEGFP-N1载体同源重组，将同源重组产物转化大肠杆菌DH5α，经筛选、鉴定后，构建得到带绿色荧光报告基团的pEGFP-GADD45a的重组质粒。2.根据权利要求1所述的猪GADD45a荧光示踪表达载体的构建方法，其特征是：引物Ⅰ为：GADD45a-F：ATGACTTTGGAGGAATTCTCGGCGADD45a-R：TCACCGTTCAGGAAGATTAATCACTG引物Ⅱ为：XhoI-GADD45a-F：ctaccggactcagatctcgagccaccATGACTTTGGAGGAATTCTCGGXhoI-GADD45a-R：aattcgaagcttgagctcgagCCGTTCAGGAAGATTAATCACTGG。3.根据权利要求2所述的猪GADD45a荧光示踪表达载体的构建方法，其特征是：所述步骤2)为：将pEGFP-N1质粒进行XhoI酶...

【专利技术属性】
技术研发人员：单体中，有文静，刘嘉琪，徐子叶，孙晔，汪以真，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33