本发明专利技术属于农业生物技术领域，具体涉及比活和热稳定性提高的碱性蛋白酶突变体及其编码基因和应用。本发明专利技术的碱性蛋白酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。本发明专利技术突变体比活力比野生型的比活力提高了15％；酶促反应最适温度不变；最适pH值降低了0.5；在55℃和60℃条件下，突变体热稳定性均较野生型有所提高。因此，本发明专利技术的碱性蛋白酶突变体PROK‑M比野生型的活性高且更耐高温。
PROK-M mutant of alkaline protease with improved specific activity and thermal stability and its coding gene and Application
The invention belongs to the field of agricultural biotechnology, in particular to alkaline protease mutants with improved specific activity and thermal stability, and their coding genes and applications. The amino acid sequence of the alkaline protease mutant of the present invention is shown in SEQ ID No.3. The specific activity of the mutant is 15% higher than that of the wild type, the optimum temperature for enzymatic reaction is unchanged, the optimum pH value is reduced by 0.5, and the thermal stability of the mutant is improved compared with that of the wild type under the conditions of 55 ~60 ~C. Therefore, the alkaline protease mutant PROK_M of the present invention has higher activity and higher heat resistance than the wild type.
【技术实现步骤摘要】
比活和热稳定性提高的碱性蛋白酶突变体PROK-M及其编码基因和应用
本专利技术属于农业生物
，具体涉及比活和热稳定性提高的碱性蛋白酶突变体及其编码基因和应用。
技术介绍
蛋白酶是指通过切割肽键实现蛋白质及多肽降解的一类酶分子，其广泛分布于微生物、动物和植物中，其中，微生物是工业用蛋白酶的主要来源。根据蛋白酶最适作用pH可以将其分为酸性蛋白酶、碱性蛋白酶和中性蛋白酶三类。其中，碱性蛋白酶的分子量较小，在26-34kDa之间，其最适作用pH范围为9.5-10.5，在pH5.0-10.0条件下较为稳定。碱性蛋白酶的活性中心一般为丝氨酸，易被二异丙基氟磷酸及苯甲基磺酸氯所抑制，但不受巯基试剂和金属螯合剂的影响。在工业应用中，不但要求碱性蛋白酶快捷、高效、低成本，而且常常需要碱性蛋白酶能够适应较高的温度，而现有的碱性蛋白酶的酶活性、热稳定性往往达不到上述要求。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种比活和热稳定性提高的碱性蛋白酶突变体。本专利技术的再一目的在于提供上述碱性蛋白酶突变体的编码基因。本专利技术的再一目的在于提供含有碱性蛋白酶突变体编码基因的重组表达载体。本专利技术的再一目的在于提供含有碱性蛋白酶突变体编码基因的重组菌株。本专利技术的再一目的在于提供制备上述碱性蛋白酶突变体的方法。本专利技术的再一目的再于提供上述碱性蛋白酶的应用。本专利技术的野生型碱性蛋白酶的氨基酸序列如SEQIDNo.1所示：其中，含有前导肽氨基酸序列“APAVEQRSEAAPLIEARGEMVANKYIVKFKEGSALSALDAAMEKISGKPDHVYKNVFSGFAATLDENMVRVLRAHPDVEYIEQDAVVTIN”。编码本专利技术的野生型碱性蛋白酶的基因的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示：其中，含有前导肽对应核苷酸序列“GCTCCAGCTGTTGAGCAAAGATCCGAAGCTGCACCATTGATTGAAGCAAGAGGTGAGATGGTCGCTAACAAGTACATCGTTAAGTTCAAGGAGGGTTCTGCTCTTTCTGCTCTAGACGCAGCTATGGAGAAGATTTCTGGTAAACCAGATCACGTCTACAAGAACGTCTTCTCTGGTTTCGCTGCAACCTTGGACGAGAACATGGTTAGAGTCTTGAGAGCTCATCCAGACGTTGAGTACATTGAACAAGACGCTGTTGTCACCATCAAT”。本专利技术通过对野生型碱性蛋白酶R308位点实施定点突变，获得R308S突变体，碱性蛋白酶突变体PROK-M的氨基酸序列如SEQIDNo.3所示：成熟的碱性蛋白酶突变体PROK-M的氨基酸序列如SEQIDNo.4所示：AAQTNAPWGLARISSTSPGTSTYYYDESAGQGSCVYVIDTGIEASHPEFEGRAQMVKTYYASSRDGNGHGTHCAGTVGSRTYGVAKKTQLFGVKVLDDNGSGQYSTIIAGMDFVASDHNNRNCPKGVVASLSLGGGYSSSVNSAAARLQSSGVMVAVAAGNNNADARNYSPASEPSVCTVGATDRYDRRSSFSNYGSVLDIFAPGTSILSTWIGGSTSSISGTSMATPHVAGLAAYLMTLGRTTAANACRYIADTANKGDLSNIPFGTVNLLAYNNYQA*编码本专利技术的碱性蛋白酶突变体的基因的核苷酸序列如SEQIDNo.5所示：本专利技术的碱性蛋白酶突变体的cDNA的核苷酸序列如SEQIDNo.6所示：GCAGCTCAGACTAACGCTCCTTGGGGTTTGGCAAGAATCTCTTCCACTTCACCAGGTACATCTACGTACTACTACGACGAGTCTGCTGGTCAAGGTTCTTGTGTGTACGTCATTGATACTGGTATCGAAGCTTCTCACCCTGAGTTCGAAGGTAGAGCTCAGATGGTTAAGACTTACTACGCTTCATCTAGAGACGGAAACGGTCACGGTACACATTGCGCTGGTACCGTCGGATCTAGAACTTACGGTGTTGCTAAGAAGACCCAGTTGTTCGGAGTGAAGGTTCTCGACGATAACGGATCTGGTCAGTACTCCACTATCATCGCTGGTATGGACTTTGTCGCTTCCGATCACAACAACAGAAACTGTCCAAAGGGTGTGGTAGCTTCCCTGTCATTAGGTGGAGGCTACTCTTCCTCTGTTAACTCTGCTGCTGCTAGATTGCAATCCTCTGGTGTCATGGTGGCTGTTGCAGCTGGAAACAACAACGCTGACGCAAGAAACTACTCCCCAGCTTCCGAACCTTCTGTCTGCACTGTTGGTGCTACCGACAGATACGATAGAAGATCCTCTTTCTCTAACTACGGTTCTGTCTTGGACATCTTCGCTCCAGGAACCTCTATCTTGTCCACTTGGATCGGTGGATCTACCTCTTCCATCTCTGGTACATCCATGGCTACTCCTCACGTTGCTGGTTTGGCTGCATACTTGATGACTCTGGGAAGAACTACCGCTGCCAACGCTTGTAGATACATTGCAGACACCGCTAACAAGGGAGACTTGTCTAACATCCCATTCGGAACTGTTAACTTGCTTGCCTACAACAACTACCAGGCTTAA本专利技术还提供了一种制备上述碱性蛋白酶突变体PROK-M的方法，其包括以下步骤：1)用含有编码碱性蛋白酶突变体PROK-M基因的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；2)培养重组菌株，诱导重组碱性蛋白酶表达；3)回收并纯化所得的碱性蛋白酶PROK-M。本专利技术还提供包含上述碱性蛋白酶突变体PROK-M基因的重组表达载体，表达质粒载体优选为pPIC9。本专利技术还提供包含上述碱性蛋白酶突变体PROK-M基因的重组菌株，菌株优选为毕赤酵母GS115。本专利技术通过对野生型碱性蛋白酶R308位点实施定点突变，获得R308S突变体。用含有突变体基因的重组载体转化毕赤酵母GS115，通过牛奶双层平板筛选出表达活性的转化子。挑选出圈快且水解圈大的转化子进行大瓶诱导，蛋白浓缩纯化后得到碱性蛋白酶突变体PROK-M。以酪蛋白为底物进行基本酶学性质测定发现，突变体比活力比野生型的比活力提高了15％；酶促反应最适温度不变；最适pH值降低了0.5；在55℃和60℃条件下，突变体热稳定性均较野生型有所提高。因此，本专利技术的碱性蛋白酶突变体PROK-M比野生型的活性高且更耐高温。附图说明图1显示在毕赤酵母中表达的突变体和野生型碱性蛋白酶基因的SDS-PAGE分析结果；图2显示碱性蛋白酶突变体与野生型的最适pH情况；图3显示碱性蛋白酶突变体与野生型的最适温度情况；图4为碱性蛋白酶突变体与野生型的酶活性比较图；图5显示碱性蛋白酶突变体与野生型在55℃下的稳定性情况；图6显示碱性蛋白酶突变体与野生型在60℃下的稳定性情况。具体实施方式试验材料和试剂1、菌株及载体：表达宿主Pichi本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.比活和热稳定性提高的碱性蛋白酶突变体，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID No.3或SEQ ID No.4所示。
【技术特征摘要】
2018.12.11 CN 20181150801531.比活和热稳定性提高的碱性蛋白酶突变体，其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDNo.3或SEQIDNo.4所示。2.比活和热稳定性提高的碱性蛋白酶突变体基因，其特征在于，编码权利要求1所述的比活和热稳定性提高的碱性蛋白酶突变体。3.根据权利要求1所述的比活和热稳定性提高的碱性蛋白酶突变体基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNo.5或SEQIDNo.6所示。4.包含...
【专利技术属性】
技术研发人员：涂涛，罗会颖，任雅馨，黄火清，姚斌，苏小运，王亚茹，王苑，柏映国，孟昆，
申请(专利权)人：中国农业科学院饲料研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11
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