一种能耐受高浓有机酸的β-葡萄糖苷酶高通量筛选方法技术

本发明专利技术一种能耐受高浓有机酸的β‑葡萄糖苷酶高通量筛选方法是将定向进化或宏基因组技术获得含有β‑葡萄糖苷酶的重组菌接种到多孔板中进行液体发酵；发酵液经离心分离后，取定量β‑葡萄糖苷酶液于多孔板中，加入七叶苷与枸橼酸铁铵混合液作为底物，以不同浓度有机酸作为抑制因子，柠檬酸缓冲液定容后，经20‑100℃反应1h，再沸水浴5‑10min，将酶完全失活；产物冷却至室温后，根据540nm‑580nm波长测定吸光度值；以水解七叶苷与柠檬酸铁铵生成黑色深浅作为β‑葡萄糖苷酶耐受有机酸的指标，高通量筛选具有耐受高浓有机酸的β‑葡萄糖苷酶。本发明专利技术方法简便，效率高，能够快速、准确筛选出所需的β‑葡萄糖苷酶。

A High Throughput Screening Method for Beta-Glucosidase Resistant to High Concentration Organic Acids

The method for high throughput screening of beta glucosidase tolerant to high concentration organic acid is to inoculate recombinant bacteria containing beta glucosidase obtained by directional evolution or macrogenomic technology into porous plate for liquid fermentation; after centrifugal separation of fermentation broth, a quantitative beta glucosidase broth is taken into porous plate, and a mixture of heptafolium glycoside and ammonium ferric citrate is added as a substrate. The enzyme was completely inactivated by reacting with citric acid buffer at 20 100 C for 1 h and then boiling water for 5 10 min. After the product was cooled to room temperature, the absorbance value was determined at 540 nm 580 nm wavelength. The black depth of hydrolysis of heptafolium glycoside and ammonium ferric citrate was used as the index of tolerance of beta-glucosidase to organic acids, and high throughput screening showed that the enzyme was tolerant to organic acids. High concentration of organic acid beta glucosidase. The method of the invention is simple and efficient, and can quickly and accurately screen the required beta glucosidase.

【技术实现步骤摘要】
一种能耐受高浓有机酸的β-葡萄糖苷酶高通量筛选方法
本专利技术涉及一种能耐受高浓有机酸的β-葡萄糖苷酶高通量筛选方法，具体属于生物化工

技术介绍
β-葡萄糖苷酶是纤维素酶系中一类酶，在纤维素的水解中起到重要作用。但是在水解过程中受到有机酸抑制因子的影响，会降低其水解效率。在目前的研究中，通过定向进化或宏基因组技术来得到具有不同耐受性的突变酶，方法复杂、成本昂贵，且假阳性较多，比如平板筛选法和pNPG法。水杨苷法可以用DNS试剂测定β-葡萄糖苷酶的活性，但是由于DNS试剂里面的碱会跟抑制剂有机酸进行化学中和反应，使试剂不能显色，这限制了该方法的应用。
技术实现思路
为了克服上述问题，本专利技术提供了一种能耐受高浓度有机酸的β-葡萄糖苷酶高通量筛选方法，能够简单快速地筛选出所需要的β-葡萄糖苷酶。本专利技术一种能耐受高浓有机酸的β-葡萄糖苷酶高通量筛选方法是将定向进化或宏基因组技术获得含有β-葡萄糖苷酶的重组菌接种到多孔板中进行液体发酵；发酵液经离心分离后，取定量的1-300微升β-葡萄糖苷酶液于多孔板中，加入七叶苷与0.001-100mmol/l的枸橼酸铁铵的混合液作为底物，以0.01-14mg/ml的有机酸作为抑制因子，经20-100℃反应1h后，再沸水浴5-10min，将酶完全失活；产物冷却室温后，根据540nm-580nm波长测定吸光度值；根据水解七叶苷与柠檬酸铁铵产生的黑色深浅作为显示β-葡萄糖苷酶耐受有机酸的指标，高通量筛选具有耐受高浓度有机酸的β-葡萄糖苷酶。所述的测定吸光度值在540nm-580nm。所述的β-葡萄糖苷酶来源于但不限于微生物。本专利技术的有益效果：本专利技术通过定向进化或宏基因组技术得到的β-葡萄糖苷酶在底物存在的条件下，与底物反应生成黑色化合物，以颜色深浅作为显示β-葡萄糖苷酶耐受有机酸的指标，高通量筛选具有耐受高浓度有机酸的β-葡萄糖苷酶。本专利技术筛选方法简便，效率高，能够快速、准确地筛选出所需要的β-葡萄糖苷酶。具体实施方式通过以下具体实施案例，对本专利技术作详细说明，本专利技术的保护内容不局限于以下实施例。本专利技术采用定向进化或宏基因组技术所得到的含有草酸青霉16β-葡萄糖苷酶的重组毕赤酵母，接种到多孔板中进行液体培养基发酵培养48h。离心取上清加入到含有适量七叶苷与10mmol/l的枸橼酸铁铵的混合溶液的多孔板中，于50℃中水浴1h，冷却后测定OD，产生颜色深的即为能耐受高浓度有机酸的β-葡萄糖苷酶。实施例1取50ulβ-葡萄糖苷酶酶液，加入100ul七叶苷与枸橼酸铁铵的混合溶液（10mmol/l），按甲酸的最终浓度为0、0.2mg/ml、0.4mg/ml、0.6mg/ml、0.8mg/ml、1.0mg/ml加入适量甲酸溶液（100mg/ml）。用柠檬酸缓冲液（pH5.0）定容至1ml，于50℃反应1h后沸水浴10min，将酶完全失活，冷却后于在550nm测定吸光度。通过这个高通量的筛选方法，获得了耐有机酸的突变酶，编号为C4。与原始酶比较起来，C4突变酶的有机酸耐受性提高了约1.15倍。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种能耐受高浓有机酸的β‑葡萄糖苷酶高通量筛选方法，其特征在于：所述的筛选方法是将定向进化或宏基因组技术获得含有β‑葡萄糖苷酶的重组菌接种到多孔板中进行液体发酵；发酵液经离心分离后，取定量的1‑300微升β‑葡萄糖苷酶液于多孔板中，加入七叶苷与0.001‑100 mmol/l的枸橼酸铁铵的混合液作为底物，以0.01‑14mg/ml的有机酸作为抑制因子，经20‑100℃反应1h后，再沸水浴5‑10min，将酶完全失活；产物冷却室温后，根据540nm‑580nm波长测定吸光度值；根据水解七叶苷与柠檬酸铁铵产生的黑色深浅作为显示β‑葡萄糖苷酶耐受有机酸的指标，高通量筛选具有耐受高浓度有机酸的β‑葡萄糖苷酶。

【技术特征摘要】
1.一种能耐受高浓有机酸的β-葡萄糖苷酶高通量筛选方法，其特征在于：所述的筛选方法是将定向进化或宏基因组技术获得含有β-葡萄糖苷酶的重组菌接种到多孔板中进行液体发酵；发酵液经离心分离后，取定量的1-300微升β-葡萄糖苷酶液于多孔板中，加入七叶苷与0.001-100mmol/l的枸橼酸铁铵的混合液作为底物，以0.01-14mg/ml的有机酸作为抑制因子，经20-100℃反应1h后，再沸水浴5-10min，将酶完全失活；产物冷却室温后...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵喜华，李汉昕，易拾，黄秋霞，
申请(专利权)人：江西师范大学，
类型：发明
国别省市：江西,36