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拟南芥FIPV启动子融合GUS基因的表达载体构建方法技术

技术编号:21025146 阅读:33 留言:0更新日期:2019-05-04 02:21
本发明专利技术是一种拟南芥FIPV启动子融合GUS基因的表达载体构建方法,以拟南芥Col‑01周大的植株为材料,采用CTAB法提取其基因组DNA(gDNA),设计特异性引物(F和R)扩增FIPV基因启动子,以提取的gDNA为模板,设计的F和R为特异性引物,进行PCR反应再经过酶切,与Gateway兼容的载体pENTR 3C进行连接,构建克隆载体pENTR FIPV‑Promoter,然后将pENTR FIPV‑Promoter与包含GUS报告基因的载体pMDC162进行LR反应,得到FIPV‑Promoter融合GUS的表达载体pMDC FIPV‑Promoter‑GUS。

Construction of expression vector of Arabidopsis thaliana FIPV promoter fusing GUS gene

The present invention is an expression vector construction method of Arabidopsis thaliana FIPV promoter fusing GUS gene. The genomic DNA (gDNA) of Arabidopsis thaliana Col. 01 week-old plant is extracted by CTAB method, the specific primers (F and R) are designed to amplify the promoter of FIPV gene, the extracted gDNA is used as template, the F and R are designed as specific primers, the PCR reaction is carried out and then digested by enzyme, and the compatible load with Gateway is carried out. The cloning vector pENTR FIPV Promoter was constructed by ligating the body pENTR 3C, then LR reaction was carried out between pENTR FIPV Promoter and pMDC162 containing GUS reporter gene, and the expression vector pMDC FIPV Promoter GUS fused with GUS was obtained.

【技术实现步骤摘要】
拟南芥FIPV启动子融合GUS基因的表达载体构建方法
本专利技术属于分子生物学和生物
,具体涉及一种拟南芥FIPV启动子融合GUS基因的表达载体构建方法。
技术介绍
植物能够吸收土壤中的NO3-、NH4+和有机氮,绝大多数的陆生植物吸收氮素以NO3-形式为主。大量的研究表明,NO3-不但是一种营养元素,而且还是一种信号分子,在植物短期和长期生长与发育过程中起重要作用。短期效应主要体现在硝态氮初级响应,即施加NO3-时植物体内有超过1000多个基因的表达迅速发生变化,比如NRTs,NIAs和NiR在NO3-处理几分钟内被诱导表达。长期效应表现在NO3-影响植物根系形态建成、种子休眠、开花、生物钟和不依赖于ABA的气孔关闭和生长素运输等过程。近十年来,一些重要的参与NO3-初级响应过程并影响NO3-代谢过程的调控基因被鉴定。这些调控基因包括转运蛋白类,如NRT1.1;蛋白激酶类,如CIPK8和CIPK23;转录因子类,如NLP7、TGA1、TGA4、TCP20、NRG2等;microRNA类,如micR167。最近的研究表明,参与真核生物mRNA前体3’末端加工的多聚腺苷酸化复合体(CPSF)在调控硝态氮信号途径中起重要作用。FIPV是CPSF的关键成员,极有可能调控植物的硝态氮感知、吸收、转运和同化等过程。因此鉴定该基因的功能对于研究植物硝态氮代谢过程,进而提高植物氮素利用率非常重要。真核生物的启动子是调控基因表达的关键顺式作用元件,一般位于结构基因的5’端上游。一个典型的启动子包含CAAT-BOX和TATA-BOX,为RNA聚合酶II提供识别和结合位点。由于植物结构基因在基因组中的位置不同,上游很可能存在其他基因的外显子或某些特殊序列,因此植物基因的启动子长度一般差异很大。对植物基因启动子的研究是解析基因转录调控和基因表达模式的关键环节,也是对基因进行功能鉴定的首要步骤。在研究工作中,常需要将基因启动子与GUS(β-葡萄糖苷酸酶)报告基因融合构建表达载体。该表达载体转化植物后,如加入GUS的底物5-溴-4-氯-3-吲哚-β-葡萄糖苷酸(X-Gluc)后,则转基因植物会在该启动子驱动的GUS表达部位与底物发生反应从而生成蓝色产物。根据蓝色产物的多少和产生位置,可以鉴定启动子转录效率和表达模式。因此,要研究FIPVPromoter的转录活性和表达模式,必须建构含有FIPVPromoter融合GUS报告基因的表达载体。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种拟南芥FIPV启动子融合GUS基因的表达载体构建方法。为了实现上述目的,本专利技术采用的技术方案为:本专利技术是一种拟南芥FIPV启动子融合GUS基因的表达载体构建方法,包括拟南芥FIPV基因启动子的DNA序列如序列表中拟南芥Col-0FIPV基因启动子序列,拟南芥FIPV基因启动子的克隆方法如下:1)以拟南芥Col-01周大的植株为材料,采用CTAB法提取其gDNA,设计特异性引物(F和R)扩增FIPV基因启动子:F(正向引物):5’-CGGGGTACCATTCTTCGGTTTTCCGGT-3’;R(反向引物):5’-CCGCTCGAGACCGGAAAACCGAAGAAT-3’;2)以提取的gDNA为模板,设计的F和R为引物,进行PCR反应,产物凝胶回收后通过酶切连接入Gateway兼容的载体pENTR3C,构建克隆载体pENTRFIPV-Promoter,然后将pENTRFIPV-Promoter与包含GUS报告基因的载体pMDC162进行LR反应,得到包含FIPV-Promoter融合GUS的表达载体pMDCFIPV-Promoter-GUS,转化感受态大肠杆菌DH5α,对pMDCFIPV-Promoter-GUS序列测定后得到拟南芥FIPV基因启动子序列所示:用限制性内切酶KpnI和XhoI分别对PCR产物和Gateway兼容的载体pENTR3C进行双酶切,将得到的含有黏性末端的FIPVPromoter连接入酶切开的pENTR3C构建克隆载体pENTRFIPV-Promoter,然后将pENTRFIPV-Promoter与包含GUS报告基因的载体pMDC162进行LR反应,得到包含FIPV-Promoter融合GUS的表达载体pMDCFIPV-Promoter-GUS。所用的拟南芥为Col-0。首次克隆到了拟南芥FIPV基因的启动子序列,具体序列如下:ATTCTTCGGTTTTCCGGTGAGAACGAGCTTCCCAGAACCAGAACCCTAAACACAGAACCTTTCTTAGTTTTCCGGTGAAAGAATCTGAAGATGCTTTTGTTTATTGCAACCTGGTTTGTCTTTTGGTTCGATGAAAGTACAAAAAAAGAGTTTATTTACATTTTTGTTAATATTAATTTTTACTTTTTCACTAATCCTAATTGGGGTAGAAAAAAAAAGGGGTAAATAAGTGTATAAATAAGACCCTAGCGATGATAAAAAGAAGCCGAGACTTGTTGAGAAGAAGCCCTTAAAGCTTCACCGTCTCTCTCTCTCTCTTTCTCGTGAGCTTCAATTCGAATCGGCCGTTCTTCTTCTTCTTCCTCCAATCTCTTTACTCCA。含拟南芥FIPV启动子融合GUS报告基因的植物表达载体的构建,方法如下:提取拟南芥中的gDNA;以gDNA为模板,使用设计的引物F和R,PCR扩增得到上游和下游分别引入KpnI和XhoI酶切位点的FIPV基因启动子;其中,所述的特定引物F和R是:F(正向引物):5’-CGGGGTACCATTCTTCGGTTTTCCGGT-3’;R(反向引物):5’-CCGCTCGAGACCGGAAAACCGAAGAAT-3’;将带有酶切位点的FIPV基因启动子,连接到Gateway兼容的载体pENTR3C,构建克隆载体pENTRFIPV-Promoter,转化感受态大肠杆菌DH5α,提取重组质粒。然后将pENTRFIPV-Promoter与包含GUS报告基因的载体pMDC162进行LR反应,得到包含FIPV-Promoter融合GUS的表达载体pMDCFIPV-Promoter-GUS,转化感受态大肠杆菌DH5α,提取阳性质粒。本专利技术的有益效果为:1.本专利技术构建的拟南芥FIPV基因启动子融合GUS报告基因的植物表达载体为首次报道,可以直接用农杆菌介导的遗传转化,获得FIPV基因启动子过表达的新种质,为该启动子的功能鉴定提供基础。2.FIPV基因启动子驱动FIPV基因的表达,利用转pMDCFIPV-Promoter-GUS表达载体构建的转基因株系,通过GUS染色技术,可以直观地观察FIPV基因的表达部位和表达强度。同时,利用不同的营养条件对转基因植株进行处理时,可以确定FIPV基因启动子对于不同营养条件的响应情况和转录活性,为解析FIPV基因调控植物硝态氮代谢的功能提供了有利的条件和充分的理论依据。附图说明图1为植物表达载体pMDCFIP1-promoter-GUS构建方法示意图;图2为以拟南芥Col-0植株gDNA为模板克隆FIPV基因启动子的电泳图,其中,1—6本文档来自技高网
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【技术保护点】
1.一种拟南芥FIPV启动子融合GUS基因的表达载体构建方法,包括拟南芥FIPV基因启动子的DNA序列如序列表中拟南芥Col‑0FIPV基因启动子序列,其特征在于,拟南芥FIPV基因启动子的克隆方法如下:1)以拟南芥Col‑01周大的植株为材料,采用CTAB法提取其gDNA,设计特异性引物(F和R)扩增FIPV基因启动子:F(正向引物):5’‑CGGGGTACCATTCTTCGGTTTTCCGGT‑3’;R(反向引物):5’‑CCGCTCGAGACCGGAAAACCGAAGAAT‑3’;2)以提取的gDNA为模板,设计的F和R为引物,进行PCR反应,产物凝胶回收后通过酶切连接入Gateway兼容的载体pENTR3C,构建克隆载体pENTR FIPV‑Promoter,然后将pENTR FIPV‑Promoter与包含GUS报告基因的载体pMDC162进行LR反应,得到包含FIPV‑Promoter融合GUS的表达载体pMDC FIPV‑Promoter‑GUS,该表达载体转化感受态大肠杆菌DH5α,对pMDC FIPV‑Promoter‑GUS序列测定后得到拟南芥FIPV基因启动子序列所示:...

【技术特征摘要】
1.一种拟南芥FIPV启动子融合GUS基因的表达载体构建方法,包括拟南芥FIPV基因启动子的DNA序列如序列表中拟南芥Col-0FIPV基因启动子序列,其特征在于,拟南芥FIPV基因启动子的克隆方法如下:1)以拟南芥Col-01周大的植株为材料,采用CTAB法提取其gDNA,设计特异性引物(F和R)扩增FIPV基因启动子:F(正向引物):5’-CGGGGTACCATTCTTCGGTTTTCCGGT-3’;R(反向引物):5’-CCGCTCGAGACCGGAAAACCGAAGAAT-3’;2)以提取的gDNA为模板,设计的F和R为引物,进行PCR反应,产物凝胶回收后通过酶切连接入Gateway兼容的载体pENTR3C,构建克隆载体pENTRFIPV-Promoter,然后将pENTRFIPV-Promoter与包含GUS报告基因的载体pMDC162进行LR反应,得到包含FIPV-Promoter融合GUS的表达载体pMDCFIPV-Promoter-GUS,该表达载体转化感受态大肠杆菌DH5α,对pMDCFIPV-Promoter-GUS序列测定后得到拟南芥FIPV基因启动子序列所示:2.根据权利要求1所述的拟南芥FIPV启动子融合GUS基因的表达载体构建方法,其特征在于,用限制性内切酶KpnI和XhoI分别对PCR产物和Gateway兼容的载体pENTR3C进行双酶切,将得到的含有黏性末端的FIPVPromoter连接入酶切开的pENTR3C构建...

【专利技术属性】
技术研发人员:王超宋文路杜昕昕尹春光杜秋丽常彦红薛丽萍
申请(专利权)人:济宁学院
类型:发明
国别省市:山东,37

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