组织或牛奶中快速诊断牛结核病的PCR检测试剂盒及其检测方法技术

本发明专利技术涉及兽医微生物学诊断技术领域，尤其是组织或牛奶中快速诊断牛结核病的PCR检测试剂盒及其检测方法。该试剂盒包括盒体，所述盒体内的试剂包括：含有PCR引物对、2倍的PCR核心试剂预混物、阳性对照、阴性对照、DL2000分子量标准溶液。本发明专利技术提供了一种组织或牛奶中快速诊断牛结核病的PCR检测试剂盒及其检测方法，通过选用经比对特异性的序列zlqG片段作为扩增目的片段，具有直接确诊的效果。本试剂盒选择特异性的扩增zlqG片段引物，并优化了退火温度和反应条件，具有灵敏度高、特异性强的优点，适合临床牛样本检测。

【技术实现步骤摘要】
组织或牛奶中快速诊断牛结核病的PCR检测试剂盒及其检测方法
本专利技术涉及兽医微生物学诊断
，尤其是组织或牛奶中快速诊断牛结核病的PCR检测试剂盒及其检测方法。
技术介绍
牛结核病(BovineTuberculosis)是以渐进性消瘦、咳嗽、多种组织器官形成干酪样坏死或钙化结节为特征，主要感染动物淋巴结和肺脏的一种人兽共患慢性肉芽肿性传染病。该病主要病原是牛分支杆菌，部分由结核分支杆菌(主要引起人结核病)引起，其他分支杆菌可感染但一般不致病。在基因组水平上，牛分支杆菌和结核分支杆菌同源性达到99.95％。患病奶牛是结核病的重要传染源，牛主要通过患病呼吸道分泌物和咳嗽所产生的气溶胶感染；人则主要通过食用未经高温处理病牛的奶肉或牛奶感染。而屠宰场的检疫是防治感染牛肉进入市场的最后环节，是防止该病及其畜产品扩散、蔓延最后的关口。因此对疑似患病牛的牛奶或屠宰组织样品快速检验确诊，具有非常重要的公共卫生意义。当前，牛结核病的防控主要采取“检疫-淘汰”方法。国内外用于诊断牛结核病的检测方法,大体上可分为三大类。第一类是细菌学检查法,如涂片镜检、细菌培养及生化实验等。抗酸染色敏感性差，检出率约30％，因此具有一定局限性；结核菌培养时间长,灵敏度低,已不能满足现代临床诊断的需要。第二类是分子生物学方法,如PCR、基于TaqMan技术的实时荧光PCR、DNA图谱等，这类方法灵敏度高,特异性好。其中PCR方法又是最简单、应用最为广泛的方法。第三类是免疫学方法,如皮内变态反应、ELISA等方法。到目前为止,世界动物卫生组织(OIE)推荐的牛结核病诊断方法只有结核菌素(PPD)变态反应，但该方法存在检验时间长(72h)，主观判断性强(测皮厚)，非典型分支杆菌干扰造成非特异性反应的缺点。常规单基因PCR方法是近年来兽医微生物学领域最有价值的研究手段，技术并不复杂，但技术含量较高，主要在于分支杆菌壁厚,脂质含量高,破壁困难；此外许多样品存在TaqDNA聚合酶抑制物,此外还有大量的非特异性DNA模板竞争扩增，从而导致牛结核病组织样本提取核酸难、灵敏度低。目前，基于基因片段诊断牛分支杆菌的PCR方法很多，如特异性插入序列引物IS6110等，但成为商品化试剂盒的较少。当前，牛奶、屠宰场环节中疑似组织或淋巴结准确诊断是防范牛结核病风险的关键，传统的金标准需要进行细菌分离及生化试验鉴定，该项工作耗时长(一般至少2～3周)，技术操作繁琐，将严重延误防控牛结核病的最佳时机。
技术实现思路
为了解决
技术介绍
中描述的技术问题，本专利技术提供了一种组织或牛奶中快速诊断牛结核病的PCR检测试剂盒及其检测方法，通过选用经比对特异性的序列zlqG片段作为扩增目的片段，具有直接确诊的效果。由于牛结核病主要由牛分支杆菌引起,少部分是结核分支杆菌引起的,而zlqG片段仅在牛分支杆菌和禽分支杆菌中有存在，并且禽分支杆菌中扩增条带弱,尚未在其他相关的分支杆菌中发现该序列,鉴于禽分支杆菌一般认为对牛不致病，因此该片段非常特异，特别适合临床疑似牛场样品(牛奶、组织)的快速检测。本试剂盒选择特异性的扩增zlqG片段引物，并优化了退火温度和反应条件，具有灵敏度高、特异性强的优点，适合临床牛样本检测。本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：一种组织或牛奶中快速诊断牛结核病的PCR检测试剂盒，包括盒体，所述盒体内的试剂包括：含有PCR引物对、2倍的PCR核心试剂预混物、阳性对照、阴性对照、DL2000分子量标准溶液。具体地，所述含有PCR引物对的引物序列为：5’-ATGGCACACGGCAACGTCAG-3’；5’-AGTCAAACAGTGCAACAGGCG-3’。具体地，所述含有PCR引物对的工作浓度为10pmol/μL。具体地，所述阳性对照为牛结核参考菌株CVCC68001基因组DNA，阴性对照为ddH2O。一种组织或牛奶中快速诊断牛结核病的PCR检测试剂盒的检测方法，包括以下步骤：a.取牛身上的病变组织，组织包括肝、脾、肺、肠，将取下的病变组织上的脂肪、被膜剔除后剪碎；b.将柠檬酸钠-磷酸缓冲液与剪碎的病变组织按照比例混合后，按每1g病变组织加入5mL柠檬酸钠-磷酸缓冲液进行研磨；c.再在上述组织研磨液上加入浓度为4％的NaOH溶液，NaOH溶液与步骤b中研磨后的物质等量，继续研磨或作用5min～10min，使病变组织液化；d.将液化的病变组织移入离心管振荡混匀，75℃温浴0.5h～1h之后取出上清液，然后将液化的病变组织以15000g离心10min，弃上清液；e.取组织沉淀后，加入与上清液等量的0.01mol/LpH7.6PBS，悬浮并再次振荡混匀，随后混匀液以15000g离心10min，弃上清液，按步骤e一共重复进行2次；f.将2次混匀离心获得的沉淀物进行收集，在沉淀物中加入50μL～100μL的DNA提取液后振荡混匀，56℃温浴30min，98℃～100℃加热10min，瞬时离心，加入与DNA提取液等体积的三氯甲烷，振荡混匀，12000g离心5min，弃去上清液后，沉淀物直接用于PCR或贮存于-80℃备用；DNA提取液包含的组分为：pH值为8.0的100mmol/LTris-HCL、0.01％TritonX-100、200μg/μL蛋白酶K。一种组织或牛奶中快速诊断牛结核病的PCR检测试剂盒的检测方法，包括以下步骤：a.将奶样在4℃的温度内进行8000g离心5min后弃去乳清；b.将乳脂沉淀加入浓度为4％的NaOH溶液，NaOH溶液与乳脂沉淀等量，研磨或作用5min～10min；c将乳脂沉淀移入离心管进行充分振荡混匀，75℃温浴0.5h～1h之后取出上清液，然后将乳脂沉淀以15000g离心10min，弃上清液；d.让乳脂沉淀加入与上清液等量的0.01mol/LpH7.6PBS，悬浮并振荡混匀，再将乳脂沉淀15000g离心10min，弃上清液，步骤d一共重复进行2次；e.将乳脂沉淀中加入50μL～100μL的DNA提取液后振荡混匀，56℃温浴30min，98℃～100℃加热10min，瞬时离心，加入与DNA提取液等体积的三氯甲烷，振荡混匀，12000g离心5min，弃去上清液后，乳脂沉淀直接用于PCR或贮存于-80℃备用；DNA提取液包含的组分为：pH值为8.0的100mmol/LTris-HCL、0.01％TritonX-100、200μg/μL蛋白酶K。本专利技术的有益效果是：本专利技术提供了一种组织或牛奶中快速诊断牛结核病的PCR检测试剂盒及其检测方法，通过选用经比对特异性的序列zlqG片段作为扩增目的片段，具有直接确诊的效果。由于牛结核病主要由牛分支杆菌引起,少部分是结核分支杆菌引起的,而zlqG片段仅在牛分支杆菌和禽分支杆菌中有存在，并且禽分支杆菌中扩增条带弱,尚未在其他相关的分支杆菌中发现该序列,鉴于禽分支杆菌一般认为对牛不致病，因此该片段非常特异，特别适合临床疑似牛场样品(牛奶、组织)的快速检测。本试剂盒选择特异性的扩增zlqG片段引物，并优化了退火温度和反应条件，具有灵敏度高、特异性强的优点，适合临床牛样本检测。附图说明下面结合附图和实施例对本专利技术进一步说明。图1是本专利技术的退火温度的确定图；图2是本专利技术的敏感性检测结果图；图3是本专利技术对肺脏灵敏度检测本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种组织或牛奶中快速诊断牛结核病的PCR检测试剂盒，包括盒体，其特征是，所述盒体内的试剂包括：含有PCR引物对、2倍的PCR核心试剂预混物、阳性对照、阴性对照、DL2000分子量标准溶液。

【技术特征摘要】
1.一种组织或牛奶中快速诊断牛结核病的PCR检测试剂盒，包括盒体，其特征是，所述盒体内的试剂包括：含有PCR引物对、2倍的PCR核心试剂预混物、阳性对照、阴性对照、DL2000分子量标准溶液。2.根据权利要求1所述的组织或牛奶中快速诊断牛结核病的PCR检测试剂盒，其特征在于：所述含有PCR引物对的引物序列为：5’-ATGGCACACGGCAACGTCAG-3’；5’-AGTCAAACAGTGCAACAGGCG-3’。3.根据权利要求1所述的组织或牛奶中快速诊断牛结核病的PCR检测试剂盒，其特征在于：所述含有PCR引物对的工作浓度为10pmol/μL。4.根据权利要求1所述的组织或牛奶中快速诊断牛结核病的PCR检测试剂盒，其特征在于：所述阳性对照为牛结核参考菌株CVCC68001基因组DNA，阴性对照为ddH2O。5.根据权利要求1-4中任一项所述的组织或牛奶中快速诊断牛结核病的PCR检测试剂盒的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：a.取牛身上的病变组织，组织包括肝、脾、肺、肠，将取下的病变组织上的脂肪、被膜剔除后剪碎；b.将柠檬酸钠-磷酸缓冲液与剪碎的病变组织按照比例混合后，按每1g病变组织加入5mL柠檬酸钠-磷酸缓冲液进行研磨；c.再在上述组织研磨液上加入浓度为4％的NaOH溶液，NaOH溶液与步骤b中研磨后的物质等量，继续研磨或作用5min～10min，使病变组织液化；d.将液化的病变组织移入离心管振荡混匀，75℃温浴0.5h～1h之后取出上清液，然后将液化的病变组织以15000g离心10min，弃上清液；e.取组织沉淀后，加入与上清液等量的0.01mol/LpH7.6PBS，悬浮并再次振荡混匀，随后混匀液以15000g离心1...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱良全，丁家波，张春燕，许冠龙，秦玉明，杨劲松，冯宇，蒋卉，彭小薇，范学政，沈青春，
申请(专利权)人：中国兽医药品监察所，
类型：发明
国别省市：北京,11