一种电荷遮蔽的还原环境响应性基因载体及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种电荷遮蔽的还原环境响应性基因载体及其制备方法，涉及纳米基因转运体制备领域，基因载体包括电中性或电负性的水溶性多糖、阳离子聚合物、带负电的基因和交联剂；电中性或电负性水溶性多糖与阳离子聚合物构成多糖基接枝交联聚合物，多糖基接枝交联聚合物与带负电的基因通过静电作用形成多层级自组装的基因载体，带负电的基因负载于基因载体内部，电中性或电负性水溶性多糖位于基因载体表面；本发明专利技术提供的制备方法绿色、无污染、产量高，合成高效便捷，得到的纳米粒子粒径均一，在50nm‑300nm之间，在肿瘤的基因编辑和免疫治疗应用方面具有广阔的前景。

A Charge-Shielded Reductive Environmental Responsive Gene Carrier and Its Preparation Method

The invention discloses a charge-shielded reductive environment-responsive gene carrier and a preparation method thereof, which relates to the field of preparation of nano-gene transporter. The gene carrier includes an electrically neutral or electronegatively water-soluble polysaccharide, a cationic polymer, a negatively charged gene and a crosslinking agent; an electrically neutral or electronegatively water-soluble polysaccharide and a cationic polymer form a polysaccharide-based grafted cross-linking polymer, and many Sugar-based grafted crosslinked polymers and negatively charged genes form multi-layer self-assembled gene carriers by electrostatic interaction. Negatively charged genes are loaded inside the gene carriers, and electroneutral or electronegatively water-soluble polysaccharides are located on the surface of the gene carriers. The preparation method provided by the present invention is green, pollution-free, high yield, high efficiency and convenient synthesis, and the obtained nanoparticles are uniform in size of 50 nm. In the range of 300 nm, it has broad prospects in gene editing and immunotherapy of tumors.

【技术实现步骤摘要】
一种电荷遮蔽的还原环境响应性基因载体及其制备方法
本专利技术涉及纳米基因转运体制备领域，尤其涉及一种电荷遮蔽的还原环境响应性基因载体及其制备方法。
技术介绍
基因载体作为基因治疗的有力工具，一直是人们研究的热点。尤其在肿瘤治疗领域，纳米颗粒由于其纳米尺度，可基于EPR效应被靶向定位到肿瘤位置，因此是肿瘤治疗基因载体的首选。纳米粒子容易通过细胞膜进入细胞，能够有效负载和保护抗肿瘤治疗基因进入细胞并在细胞内释放，提高运送效率和生物利用度。目前的基因载体可分为病毒载体和非病毒载体，其中主要的非病毒基因载体有阳离子脂质体、阳离子聚合物等。常见的阳离子聚合物基因载体如聚乙烯亚胺(PEI)和聚赖氨酸(PLL)等，它们的工作原理是通过静电作用将带负电的基因压缩并形成纳米颗粒，然后通过细胞内吞机制将基因运输到细胞内。然而阳离子聚合物由于其表面携带的正电荷，在体循环过程中会与带负电的血细胞结合而增加凝血风险，同时阳离子载体在体循环中还很容易被网状内皮系统清除，从而限制了其临床应用。因此，如何屏蔽基因载体表面的正电荷是提高阳离子聚合物基因载体安全性的重要手段之一。另一方面，基因载体内部的阳离子聚合物和基因静电凝聚体对基因的有效包封及可控释放对于实现基因在细胞内部的释放和有效表达非常关键，研究表明，相比正常组织，肿瘤细胞内还原性物质积聚，如谷胱甘肽(glutathione，GSH)的浓度最高可达2-20mM。因此，设计一种在正常生理环境中保持稳定，而在细胞内还原环境下降解，从而实现基因在细胞内部的释放和有效表达的基因载体对于其实际应用具有重要意义。因此，本领域的技术人员致力于开发一种电荷遮蔽的还原环境响应性基因载体。
技术实现思路
有鉴于现有技术的上述缺陷，本专利技术所要解决的技术问题是现有阳离子聚合物基因载体由于其携带的正电荷而导致的细胞毒性及不稳定性，并且不能在细胞内还原环境的影响下分解从而释放出包封在内部的基因。为实现上述目的，本专利技术提供了一种基因载体，其实现了对阳离子聚合物正电荷的遮蔽，同时该基因载体内部存在还原环境敏感的二硫键的交联，能够在还原环境下降解，使得基因在细胞内部释放和有效表达，在肿瘤的基因编辑和免疫治疗应用方面具有广阔的前景。在一个具体实施方式中，基因载体包括多糖、阳离子聚合物、基因和交联剂；多糖为电中性或电负性的水溶性多糖，所述电中性或电负性水溶性多糖与所述阳离子聚合物构成多糖基接枝交联聚合物，所述多糖基接枝交联聚合物与所述基因通过静电作用形成基因载体，所述基因负载于基因载体内部，所述电中性或电负性水溶性多糖位于基因载体表面。进一步地，交联剂具有还原环境响应性的二硫键。另一方面，本专利技术还提供了一种制备上述基因载体的方法，在一个具体实施方式中，包括以下步骤：(1)制备电中性或电负性水溶性多糖的水溶液，惰性气体保护下加入引发剂，搅拌混匀；(2)加入阳离子单体或溶于溶剂的阳离子单体，搅拌混匀；(3)加入还原环境敏感的交联剂，惰性气体保护下进行聚合及交联反应；(4)透析处理，冷冻干燥得到接枝交联聚合物；(5)得到的接枝交联聚合物与基因混合，通过静电作用力形成静电凝聚体，即基因载体。进一步地，步骤(1)中的引发剂为硝酸铈铵。进一步地，步骤(1)中的电中性或电负性水溶性多糖为葡聚糖、海藻酸、水溶性淀粉、羧甲基葡聚糖、羧甲基纤维素、透明质酸、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素和普鲁兰多糖中的一种或多种。进一步地，步骤(2)中的阳离子单体为甲基丙烯酸二乙氨基乙酯(cas:924-99-2)、甲基丙烯酸二乙基氨基乙酯(cas:105-16-8)、甲基丙烯酸二甲氨乙酯(cas:2867-47-2)、丙烯酸二甲氨基乙酯(cas:2439-35-2)、丙烯酸N,N-二乙基氨基乙酯(cas:2426-54-2)、2-甲基-2-丙烯酸2-(4-吗啉基)乙基酯(cas:2997-88-8)、丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵(cas:44992-01-0)、甲基丙烯酸2-氨基乙基酯盐酸盐(cas:2420-94-2)、甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵(cas:5039-78-1)中的一种或多种。进一步地，步骤(3)中的还原环境敏感的交联剂为二烯丙基二硫、L-胱氨酸双丙烯酰胺、双丙烯酰胱胺或双(2-甲基丙烯酰氧基乙基)二硫醚中的一种或多种。进一步地，步骤(5)中的基因为质粒、siRNA、microRNA、piRNA、circleRNA和lncRNA中的一种或多种。进一步地，惰性气体为氮气。另一方面，本专利技术还提供了一种对上述基因载体进行功能修饰的方法，在一个具体实施方式中，通过共价键或非共价键将蛋白或多肽或功能化合物结合到接枝交联聚合物上，或结合到水溶性多糖的羧基上，再进一步聚合形成接枝交联聚合物。进一步地，功能修饰使用的化学偶联基团为EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)、NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)、SPDP(3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯)和SMCC(琥珀酰亚胺-4-(N-马来酰亚胺)环已烷-1-1羟酸酯)中的一种或多种。本专利技术一方面为了同时实现可利用静电力包封基因、并使用中性生物大分子对载体内部电荷进行屏蔽以降低生物毒性的双重目的，提供了由电中性或电负性的多糖与阳离子聚合单体合成高分子接枝链组成的多糖基接枝交联共聚物，该多糖基接枝交联共聚物通过各单体的自由基接枝共聚合实现；另一方面为了实现负载基因后载体的结构稳定性和细胞内微环境敏感性，进一步在阳离子聚合物接枝链上进行了含二硫键双官能团交联剂的共聚。当多糖基接枝交联共聚物与带负电的基因混合时，由于基因与阳离子接枝链的静电相互作用，实现了静电驱动诱导的自组装，形成静电凝聚体，即电荷遮蔽的还原环境响应性基因载体。该电荷遮蔽的还原环境响应性基因载体为多层级结构，具体表现为基因与阳离子聚合物接枝链形成静电凝聚体的内核结构，电中性或电负性且亲水的多糖在凝聚体的表面形成多层级组装体的外壳结构；并且这一多层级组装体内部存在二硫键的交联，使其具有环境敏感性的特点，能够在还原环境下降解，使得基因在细胞内部释放和有效表达。本专利技术提供的制备方法绿色、无污染、产量高，合成高效便捷，得到的纳米粒子粒径均匀，在50nm-300nm之间，在肿瘤的基因编辑和免疫治疗应用方面具有广阔的前景。以下将结合附图及具体实施例对本专利技术的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本专利技术的目的、特征和效果。附图说明图1是本专利技术的一个实施例提供的一种电荷遮蔽的还原环境响应性基因载体的结构示意图；图2是本专利技术的一个实施例提供的一种电荷遮蔽的还原环境响应性基因载体的制备流程示意图；图3是本专利技术一个较佳实施例的电荷遮蔽的还原环境响应性基因载体细胞转染荧光显微镜镜检结果图。其中：1-基因，2-阳离子聚合物，3-多糖。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术的
技术实现思路
做进一步的说明：下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本专利技术的保护范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下面实施例中涉及的质粒、基因来源和/或功能说明如下：pEGFP-C1质粒：购自Clontech，带有绿本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基因载体，其特征在于，所述基因载体包括多糖、阳离子聚合物、基因和交联剂；所述多糖为电中性或电负性的水溶性多糖，所述电中性或电负性水溶性多糖与所述阳离子聚合物构成多糖基接枝交联聚合物，所述多糖基接枝交联聚合物与所述基因通过静电作用形成基因载体，所述基因负载于基因载体内部，所述电中性或电负性水溶性多糖位于基因载体表面。

【技术特征摘要】
1.一种基因载体，其特征在于，所述基因载体包括多糖、阳离子聚合物、基因和交联剂；所述多糖为电中性或电负性的水溶性多糖，所述电中性或电负性水溶性多糖与所述阳离子聚合物构成多糖基接枝交联聚合物，所述多糖基接枝交联聚合物与所述基因通过静电作用形成基因载体，所述基因负载于基因载体内部，所述电中性或电负性水溶性多糖位于基因载体表面。2.如权利要求1所述的基因载体，其特征在于，所述交联剂具有还原环境响应性的二硫键。3.一种制备如权利要求1或2所述的基因载体的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)制备电中性或电负性水溶性多糖的水溶液，惰性气体保护下加入引发剂，搅拌混匀；(2)加入阳离子单体或溶于溶剂的阳离子单体，搅拌混匀；(3)加入还原环境敏感的交联剂，惰性气体保护下进行聚合及交联反应；(4)透析处理，冷冻干燥得到接枝交联聚合物；(5)得到的接枝交联聚合物与基因混合，通过静电作用力形成静电凝聚体，即基因载体。4.如权利要求3所述的制备基因载体的方法，其特征在于，所述步骤(1)中的引发剂为硝酸铈铵。5.如权利要求3所述的制备基因载体的方法，其特征在于，所述步骤(1)中的电中性或电负性水溶性多糖为葡聚糖、海藻酸、水溶性淀粉、羧甲基葡聚糖、羧甲基纤维素、透明...

【专利技术属性】
技术研发人员：窦红静，王成龙，许国雄，
申请(专利权)人：上海交通大学，复旦大学附属金山医院，
类型：发明
国别省市：上海,31