用于检测桃黑星菌的LAMP引物及检测试剂盒制造技术

本发明专利技术提供用于检测桃黑星菌的LAMP引物及检测试剂盒。所述LAMP引物的序列如Seq ID No.1‑4所示。本发明专利技术将环介导恒温扩增技术用于桃黑星菌的快速检测，可从发病植物组织等复杂的病原菌环境准确地检测出桃黑星菌。该方法的特异性和灵敏度均较常规PCR方法更高，可对桃黑星菌的各种形态的繁殖体如菌丝、孢子等进行检测，对桃黑星病疫情的早期预警、疫区的病原监测等方面具有重要意义；同时可以免除高昂的仪器投入，便于基层推广使用。

LAMP Primers and Kits for Detection of Mycobacterium rubra

The invention provides a LAMP primer and a detection kit for detecting Mycobacterium rubra. The sequence of the LAMP primers is shown in Seq ID No.1 4. The invention applies the RING-mediated constant temperature amplification technology to the rapid detection of mycelium, and can accurately detect mycelium from the complicated pathogenic environment such as diseased plant tissues. The specificity and sensitivity of this method are higher than those of conventional PCR. It can detect mycelia and spores of mycelia in mycelium and spores of Mycelia, and has important significance in early warning of mycelia and pathogen monitoring in the epidemic area. At the same time, it can avoid high input of instruments and facilitate the popularization and use of mycelium and spores at the grass-roots level.

【技术实现步骤摘要】
用于检测桃黑星菌的LAMP引物及检测试剂盒
本专利技术属于植物病原菌检测
，具体地说，涉及用于检测桃黑星菌的LAMP引物及检测试剂盒。
技术介绍
由桃黑星菌(Venturiacarpophila，又名嗜果黑星菌，属子囊菌亚门球壳目黑星菌属真菌)引起的疮痂病是桃产区重要的病害之一，桃疮痂病的发生严重影响了桃的品质和价值。该病在果面产生暗褐色至黑色小点，症状易与桃穿孔病、黑斑病、溃疡病及早期炭疽病混淆，基层农技推广人员及果农难以区分，常发生病害诊断错误的案例；桃黑星菌在寄主上潜伏期长，实验室纯培养时难分离、生长慢、易污染。准确识别疮痂病对科学防治该病害至关重要。若在喷药前能够准确鉴定病原菌种类，就可以准确制定杀菌剂喷施计划，以提高防治效果，减少农药使用。目前比较常用的鉴定方法包括两种，即以发病症状为基础的传统鉴定法和基于目标基因的分子鉴定法。传统的症状识别法根据病害的发病症状进行鉴定。该方法需要从业人员具有过硬的病害识别能力和丰富的病害识别经验，但由于不同品种、不同地域、不同生长阶段病害症状不同，且疮痂病发病症状难与穿孔病、黑斑病、溃疡病、早期炭疽病症状区分，故症状识别法难以推广。同时，由于桃黑星菌难分离、生长慢、易污染等属性，分子鉴定法通常需要几周时间，工作难度及工作量大，测定样本数量有限，要求严格的无菌操作。而普通的PCR检测技术，所需仪器价格昂贵，对操作人员的技术要求较高，不适合在田间或者基层农业技术部门推广。
技术实现思路
本专利技术旨在克服现有方法检测周期长，工作量大，需要无菌条件，以及PCR技术对仪器和人员技术要求高的缺陷，提供用于检测桃黑星菌的LAMP引物及检测试剂盒，以及在此基础上建立一种基于分子水平的方便、灵敏、结果判断直观且便于基层推广使用的桃黑星菌检测方法。本专利技术构思如下：对桃黑星菌进行研究发现，桃黑星菌的ITS1/ITS4引物扩增片段147～163位碱基与相近种苹果黑星菌(Venturiainaequalis)、梨黑星菌(Venturianashicola)及症状易混淆的桃黑斑病菌(Alternariatenuissima)、桃溃疡病菌(Phomopsisamygdali)、桃炭疽病菌(Colletotrichumacutatum)存在明显差异。经验证，桃黑星菌147～163位碱基区段是区别于其他病原菌的特异位点。在此基础上设计相应引物，根据扩增结果实现对桃黑星菌的检测。为了实现本专利技术目的，第一方面，本专利技术提供用于检测桃黑星菌(Venturiacarpophila)的LAMP引物，包括(SEQIDNO:1-4)：外侧正向引物VC-F3：5’-AGCAAGCCCTGCCTAGA-3’；外侧反向引物VC-B3：5’-TGCCCCCCGGAATACCA-3’；以及内侧正向引物VC-FIP(F1c+F2)：5’-TGCCAGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAGTCTGAGGAGAAAGCC-3’；内侧反向引物VC-BIP(B1c+B2)：5’-GATGAAGAACGCAGCGAAATGCGCAATGTGCGTTCAAAGATTCGA-3’。第二方面，本专利技术提供含有所述LAMP引物的用于检测桃黑星菌的试剂及试剂盒。可选地，所述试剂盒还包括dNTPs、BstDNA聚合酶、ThermopolBuffer、MgSO4或MgCl2、甜菜碱中的至少一种。可选地，所述试剂盒还包括标准阳性模板。可选地，所述试剂盒还包括TE裂解液。第三方面，本专利技术提供所述LAMP引物或所述检测试剂/试剂盒的以下任一应用：i)在检测桃黑星菌中的应用；ii)在检测由桃黑星菌引起的植物病害中的应用。所述植物病害包括但不限于桃疮痂病。前述的应用包括以下步骤：1)提取样品中的DNA；2)以步骤1)中提取的DNA为模板，利用所述LAMP引物进行扩增反应；3)分析扩增产物。优选地，扩增反应体系以25μl计为：4UBstDNA聚合酶，2.5μL10×ThermoPolBuffer，5mMMgSO4，0.8mMdNTPs，1.2mMVC-FIP，1.2mMVC-BIP，0.4mMVC-F3，0.4mMVC-B3，0.8M甜菜碱，1μLDNA模板。扩增反应条件：61℃水浴锅中反应75min。步骤3)具体为：向步骤2)的扩增产物中加入SYBRGreenI染料(每个反应管中加入1μL1000×SYBRGreenI染料)，根据显色情况判定结果：显示绿色为阳性，橙色为阴性。第四方面，本专利技术提供基于LAMP技术(环介导恒温扩增技术)检测桃黑星菌以及由桃黑星菌引起的植物病害的方法。所述方法包括利用如SEQIDNO:1-4所示的LAMP引物对待测样品进行检测。借由上述技术方案，本专利技术至少具有下列优点及有益效果：(一)本专利技术将环介导恒温扩增技术用于桃黑星菌病菌的快速检测，可从发病植物组织及土壤中复杂的病原菌环境准确地检测出桃黑星菌。该方法的特异性和灵敏度均较常规PCR方法更高，可对桃黑星菌的各种形态的繁殖体如菌丝、孢子等进行检测，对桃黑星菌疫情的早期预警、疫区的病原监测等方面具有重要意义；同时可以免除高昂的仪器投入，便于基层推广使用。(二)利用本专利技术提供的试剂盒可在2h内从田间样本中快速、简便、准确、灵敏地检测出桃黑星菌，比传统的症状识别法和普通分子检测方法更简单、更高效。(三)本专利技术提供的LAMP引物特异性好，灵敏度高，桃黑星菌DNA的检出限为5.66fg/μl。附图说明图1为本专利技术实施例2中LAMP特异性引物对桃黑星菌及7种病原菌DNA扩增结果。图2为本专利技术实施例3中反应体系中的Mg2+浓度优化结果。图3为本专利技术实施例3中反应体系中的dNTPs浓度优化结果。图4为本专利技术实施例3中LAMP反应温度优化结果。图5为本专利技术实施例3中LAMP反应时间优化结果。图6为本专利技术实施例6中LAMP引物检测桃黑星菌的灵敏度分析结果。图7为本专利技术实施例4中LAMP特异性引物对对采自14个省区的23株桃黑星菌的扩增结果。图8为本专利技术实施例5中LAMP特异性引物对感病及健康果皮DNA的扩增结果。图9为本专利技术实施例1中桃黑星菌与其近缘物种(苹果黑星菌、梨黑星菌)的ITS1/ITS4序列比对结果。图10为本专利技术实施例1中桃黑星菌LAMP引物的设计位点。图11为本专利技术实施例1中设计的10组LAMP引物的扩增结果。其中，M:DNAMaker，1～10分别对应于1-10组LAMP引物。具体实施方式以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(SambrookJ&RussellDW，MolecularCloning:aLaboratoryManual，2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。实施例1用于检测桃黑星菌的LAMP引物的设计与合成将桃黑星菌与其近缘物种(苹果黑星菌、梨黑星菌)的ITS1/ITS4序列进行比对(用于扩增桃黑星菌ITS1/ITS4序列的引物为ITS1:5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’和ITS4:5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)，结果表明桃黑星菌ITS1/ITS4扩增片段147～163位点是区别于其他病原菌的特异识别位本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于检测桃黑星菌(Venturia carpophila)的LAMP引物，其特征在于，包括：外侧正向引物VC‑F3：5’‑AGCAAGCCCTGCCTAGA‑3’；外侧反向引物VC‑B3：5’‑TGCCCCCCGGAATACCA‑3’；以及内侧正向引物VC‑FIP：5’‑TGCCAGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAGTCTGAGGAGAAAGCC‑3；’内侧反向引物VC‑BIP：5’‑GATGAAGAACGCAGCGAAATGCGCAATGTGCGTTCAAAGATTCGA‑3’。

【技术特征摘要】
1.用于检测桃黑星菌(Venturiacarpophila)的LAMP引物，其特征在于，包括：外侧正向引物VC-F3：5’-AGCAAGCCCTGCCTAGA-3’；外侧反向引物VC-B3：5’-TGCCCCCCGGAATACCA-3’；以及内侧正向引物VC-FIP：5’-TGCCAGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAGTCTGAGGAGAAAGCC-3；’内侧反向引物VC-BIP：5’-GATGAAGAACGCAGCGAAATGCGCAATGTGCGTTCAAAGATTCGA-3’。2.含有权利要求1所述LAMP引物的用于检测桃黑星菌的试剂盒。3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括dNTPs、BstDNA聚合酶、ThermopolBuffer、MgSO4或MgCl2、甜菜碱中的至少一种。4.根据权利要求2或3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括标准阳性模板。5.权利要求1所述LAMP引物或权利要求2-4任一项所述试剂盒的以下任一应...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗朝喜，周扬，范飞，尹良芬，阴伟晓，王丽，罗梅，谭钦，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42