水稻品种IR36抗黑条矮缩病位点qRBSDV-1及其分子标记方法和应用技术

本发明专利技术涉及水稻品种IR36抗黑条矮缩病位点qRBSDV‑1及其分子标记方法和应用。本发明专利技术以水稻抗黑条矮缩病品种IR36与感黑条矮缩病品种L5494杂交构建的重组自交系群体为定位群体，通过田间自然鉴定的方法进行黑条矮缩病抗病性鉴定，获得1个来自于抗黑条矮缩病品种IR36的抗性基因位点，命名为qRBSDV‑1，位于标记AP‑39.6与RM104之间，随后本发明专利技术利用日本晴背景仅在qRBSDV‑1所在染色体区段含有93‑11导入片段的代换系（编号N9）及双亲进行分子检测及黑条矮缩病发病率鉴定，对qRBSDV‑1进行验证。本发明专利技术可以通过检测标记AP‑39.6与RM104分子标记处的带型来预测该植株对水稻黑条矮缩病的抗性，提高了抗黑条矮缩病水稻品种的育种效率。

QRBSDV-1 locus of resistance to black-streaked dwarf disease in rice variety IR36 and its molecular marker method and Application

The present invention relates to the qRBSDV_1 locus of resistance to black streak dwarf disease of rice variety IR36 and its molecular marker method and application. The recombinant inbred line population constructed by crossing IR36 with L5494, a rice variety resistant to black-streaked dwarf disease, was used as the locating population to identify the resistance to black-streaked dwarf disease by field natural identification method, and a resistance gene locus from IR36, a rice variety resistant to black-streaked dwarf disease, was obtained, named qRBSDV_1, which was located between the markers AP_39.6 and RM104, and then basically developed. In order to validate qRBSDV 1, the substitution lines (No. N9) with 93 11 introgressive fragments in the chromosome segment of qRBSDV 1 and their parents were used for molecular detection and morbidity identification of black streak dwarf disease in clear background of Japan. The invention can predict the resistance of the plant to rice black-streaked dwarf disease by detecting the band patterns at the molecular markers AP 39.6 and RM104, thereby improving the breeding efficiency of rice varieties resistant to black-streaked dwarf disease.

【技术实现步骤摘要】
水稻品种IR36抗黑条矮缩病位点qRBSDV-1及其分子标记方法和应用
本专利技术涉及水稻品种IR36中抗黑条矮缩病位点qRBSDV-1鉴定及其分子标记方法和应用，属于水稻分子育种科学

技术介绍
水稻黑条矮缩病是一种由水稻黑条矮缩病毒(Riceblack-streakeddwarfvirus,RBSDV)引起的病毒病，主要由灰飞虱以持久性不经卵的方式进行传播。水稻黑条矮缩病的典型症状是病株矮缩，叶色浓绿僵硬，叶背、叶鞘和茎杆有早期蜡白色、后期为黑褐色的短条状不规则突起，通常发病植株不抽穗或者极少结实，被喻为水稻“癌症”。上世纪60年代，水稻黑条矮缩病在我国华东诸省市大爆发，随后20年，由于麦田翻耕和早稻移栽等耕作方式的兴起，杀灭了第一代灰飞虱若虫，病害的初侵染受阻，致使发病面积逐年下降。80年代后，由于扩种小麦，又给本病初侵染创造了有利的寄主条件，致使本病在90年代于浙江、上海、江苏、安徽、江西和福建省北部等长江中下游地区再次大爆发。进入本世纪以来，随着耕作制度和栽培方式的变化、农田生态多样、冬季气候变暖和感病品种的大面积推广，水稻黑条矮缩病在江苏、浙江、河南等省大规模发生。目前，主要使用农药杀灭传毒媒介灰飞虱来防治水稻黑条矮缩病。但是由于灰飞虱数量大、具有迁徙性及耐药性高等因素，导致防治效果不佳，且存在环境污染。选育抗病品种是防治各类病害最为经济、有效的手段。但黑条矮缩病的发病规律以及发病地点较难掌控，且田间鉴定缺少稳定性，靠人工接种病毒又需大量的人工投入，这些均是研究黑条矮缩病所需面对的困难。迄今为止，在生产上还没有发现对RBSDV免疫的品种，RBSDV的抗性受多个数量性状位点控制，多个抗性基因/QTL聚合是抗黑条矮缩病品种选育的重要途径。因此，筛选水稻黑条矮缩病抗性种质，开展开水稻黑条矮缩病抗性QTL定位及连锁标记的开发显得尤为重要。
技术实现思路
为了克服上述缺陷，本专利技术对常规育种中水稻黑条矮缩病抗性鉴定稳定性、重复性较差及费时费力等缺点，提供了水稻品种IR36中抗黑条矮缩病位点qRBSDV-1及其分子标记方法，该方法可以预测植株对水稻黑条矮缩病的抗性，简化了选择方法，进而加快抗病品种的育种进程。为了实现上述专利技术目的，本专利技术采用的技术方案为：水稻品种IR36抗黑条矮缩病位点qRBSDV-1位于第1染色体上分子标记AP-39.6和RM104之间。用分子标记AP-39.6引物SEQIDNO.1/SEQIDNO.2和分子标记RM104引物SEQIDNO.3/SEQIDNO.4扩增水稻抗黑条矮缩病品种或育种材料，以验证品种或育种材料是否存在抗黑条矮缩病位点qRBSDV-1；当水稻抗黑条矮缩病品种或育种材料扩增出与IR36(亲本)同样的条带，表明水稻抗黑条矮缩病品种或育种材料内存在抗黑条矮缩病位点qRBSDV-1。水稻品种抗黑条矮缩病位点的标记方法，其特征在于，包含以下步骤：(1)构建L5494/IR36重组自交系群体；(2)对L5494/IR36重组自交系群体进行水稻抗黑条矮缩病田间自然鉴定；(3)混取亲本及群体中各家系3张叶片，采用CTAB法提取水稻全基因组DNA；(4)利用均匀分布在水稻12条染色体上的多态性标记对各家系基因型进行检测；(5)根据标记检测结果，用QTLIcimapping4.0软件MAP模板进行遗传连锁图谱的构建；(6)结合抗性表型参数，用QTLIcimapping4.0软件复合区间作图法检测水稻黑条矮缩病的抗性QTL，LOD值的阈值定为2.5，检测抗性QTL的数目及其在染色体上的位置；(7)获得水稻黑条矮缩病抗性品种IR36的1个抗黑条矮缩病基因位点qRBSDV-1，位于第1染色体上分子标记引物AP-39.6：SEQIDNO.1/SEQIDNO.2和RM104：SEQIDNO.3/SEQIDNO.4之间。所述的水稻黑条矮缩病田间自然鉴定方法和分子标记检测技术为常规方法。相对于现有技术，本专利技术的分子标记定位的抗性基因位点位置明确，鉴定方便。通过检测qRBSDV-1两侧的分子标记即可预测水稻植株的黑条矮缩病抗性水平，提高抗黑条矮缩病水稻的选择效率。附图说明图1：水稻品种IR36抗黑条矮缩病位点qRBSDV-1在染色体上的位置；图2：染色体片段代换系N9的重测序图谱；图3：qRBSDV-1两端分子标记的电泳图谱。具体实施方式为了阐述本专利技术的技术方案及技术目的，下面结合附图说明及具体实施方式对本专利技术做进一步的介绍。1、L5494/IR36重组自交系群体的构建2010年正季在扬州用感病亲本L5494与抗病亲本IR36杂交配制杂种F1，经连续自交，构建包含222个家系的重组自交系群体，至2015年为F8代，2016年为F10代。2、L5494/IR36重组自交系群体黑条矮缩病抗性表型鉴定由于近年来扬州黑条矮缩病发病较轻，难以反映不同材料的抗感差异，故2015-2016年将L5494/IR36重组自交系群体播种于河南开封重病区进行感病处理。播种田块靠近麦田，麦田不施用抗灰飞虱农药。由于水稻叶龄2时最易感黑条矮缩病毒，在幼苗期每天人工驱赶灰飞虱，以使群体充分感病。秧龄30天左右，将稻苗移栽至扬州大学试验基地种植，单苗栽插，株行距13.3㎝×25㎝，随机排列，重复两次，每次重复每个家系种植54株，常规水肥管理。表型鉴定时，发现植株较家系内正常株明显矮缩、叶色浓绿僵硬，则判定为受黑条矮缩病侵染。在水稻分蘖初期，对各家系进行一次鉴定，并用竹签对发病植株进行标记；在水稻分蘖盛期，进行第二次鉴定，统计各个家系的黑条矮缩病发病率。3、分子标记分析(1)采用CTAB法提取L5494/IR36重组自交系群体各家系及双亲DNA。(2)分子标记选取本实验室已有的134对均匀分布于12条染色体上的在LR36与L5494之间具有良好多态性的SSR标记(来源于http://www.gramene.org/)及STS标记(实验室使用Premier6.0软件自行合成)。(3)PCR扩增的反应体系为：模板DNA2μL，0.3μM引物2μL，2×EsTaqMasterMix8μL(2×EsTaqMasterMix为dNTP，Mg2+，Buffer，Taq酶的混合液)，加dd水补足至20μL。(4)PCR扩增程序为：95℃预变性5min，94℃变性40s，53-58℃退火40s，72℃延伸30-50s，由变性至延伸的过程一般需要30个循环，最后72℃保温10min。(5)扩增产物在3％的琼脂糖凝胶中进行电泳检测。4、遗传图谱构建及QTL分析根据定位群体各家系分子标记检测结果，用QTLIcimapping4.0软件MAP模板进行遗传连锁图谱的构建；结合表型数据利用软件QTLIcimapping4.0的复合区间作图法检测水稻黑条矮缩病的抗性QTL，LOD值的阈值定为2.5，检测抗性QTL的数目及其在染色体上的位置。5、抗性QTL的获取2015在第1染色体上检测到一处来源于IR36的水稻黑条矮缩病抗性QTL，LOD值为2.96，表型贡献率为8.95％，命名为qRBSDV-1，位于第1染色体上分子标记AP-39.6：SEQIDNO.1/SEQIDNO.2和RM104：SEQIDNO.3/SEQIDNO.4之间。2016年再本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.水稻品种IR36抗黑条矮缩病位点，其特征在于，所述的抗黑条矮缩病位点为

【技术特征摘要】
1.水稻品种IR36抗黑条矮缩病位点，其特征在于，所述的抗黑条矮缩病位点为qRBSDV-1，位于第1染色体上分子标记AP-39.6和RM104之间。2.根据权利要求1所述的水稻品种IR36抗黑条矮缩病位点的标记方法，其特征在于，用分子标记AP-39.6引物SEQIDNO.1/SEQIDNO.2和分子标记RM104引物SEQIDNO.3/SEQIDNO.4扩增水稻抗黑条矮缩病品种或育种材料，以验证水稻抗黑条矮缩病品种或育种材料是否存在抗黑条矮缩病位点qRBSDV-1。3.根据权利要求2所述的水稻品种IR36抗黑条矮缩病位点的标记方法，其特征在于，当水稻抗黑条矮缩病品种或育种材料扩增出与IR36同样的条带，表明水稻抗黑条矮缩品种或育种材料内存在抗黑条矮缩病位点qRBSDV-1。4.水稻品种抗黑条矮缩病位点的标记方法，其特征在于，包含以下步骤：（1）构建L5494...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘江宁，张宏根，汤述翥，刘巧泉，许作鹏，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32