一种从环境中快速富集Nitrosocosmicus属氨氧化古菌的方法技术

本发明专利技术公开一种从环境中快速富集Nitrosocosmicus属氨氧化古菌的方法。该方法包括定向富集和快速纯化两个步骤。采用石英砂作为氨氧化古菌的附着基质，并且以石英砂作为传代的种子，大大减少了在传代过程中氨氧化古菌的损失，可将大部分培养的氨氧化古菌转移到新鲜的培养基中，明显缩短了培养的周期。联用穿透生物膜能力较强的阿奇霉素与环丙沙星，快速抑制和杀灭生物膜中存在的共生细菌，在一个培养周期内使氨氧化古菌的丰度达到90％以上。本方法可在几个月内获得高纯度的氨氧化古菌富集物，明显缩短了氨氧化古菌富集培养所需的时间和培养难度，为氨氧化古菌的研究与应用奠定了基础。

A Method for Rapid Enrichment of Nitrosocosmicus Ammonia-oxidizing Archaea from the Environment

The invention discloses a method for rapidly enriching Nitrosocosmicus ammonia oxidizing archaea from the environment. The method consists of two steps: directional enrichment and rapid purification. Quartz sand was used as the attachment matrix of ammonia-oxidizing archaea, and quartz sand was used as the seed of passage, which greatly reduced the loss of ammonia-oxidizing archaea in the passage process. Most of the cultured ammonia-oxidizing archaea could be transferred to fresh culture medium, and the culture cycle was obviously shortened. The combination of azithromycin and ciprofloxacin with strong penetrating ability can rapidly inhibit and kill the symbiotic bacteria in the biofilm, and make the abundance of ammonia-oxidizing archaea reach more than 90% in one culture cycle. This method can obtain high purity ammonia-oxidizing archaea concentrate in a few months, obviously shorten the time and difficulty of enrichment and cultivation of ammonia-oxidizing archaea, and lay a foundation for the research and application of ammonia-oxidizing archaea.

【技术实现步骤摘要】
一种从环境中快速富集Nitrosocosmicus属氨氧化古菌的方法
本专利技术涉及了基于定向富集和快速纯化的原理从环境中快速富集Nitrosocosmicus属氨氧化古菌的方法。
技术介绍
自养氨氧化是将氨氮氧化成硝酸盐氮的第一步，是全球氮循环的核心。该生化反应长期被认为只由来自变形菌门的氨氧化细菌承担。近年来的研究发现，来自奇古菌门(thaumarchaeota)的氨氧化古菌也可以进行氨氧化作用。直到2005年才成功地分离出第一株氨氧化古菌。氨氧化古菌与氨氧化细菌的总化学计量学没有区别，但氨氧化古菌对氨氮和氧气的亲和力要比氨氧化细菌高得多，因而能够适应于各种营养限制下的生境。它们的生境范围比大得多。氨氧化古菌在全球氮循环中发挥着重要作用；然而，他们的作用尚未像氨氧化细菌那样得到广泛的研究。也几乎没有在工业生产和环境治理等方面得到应用。这与氨氧化古菌的难于培养的性质有很大的关系。难培养的原因主要在于其最大比生长速率低和低浓度氨和亚硝酸盐对其生长的抑制作用。目前虽然距培养出第一株氨氧化古菌已过去了十几年的时间，但培养得到的氨氧化古菌的菌株仍然十分稀少，这是因为其培养周期很长，通常从环境中得到高纯度的氨氧化古菌的富集物需要2～3年。其应用价值也受到了培养难度的制约。特别地，Nitrosocosmicus属氨氧化古菌具有较强氨氮耐受能力，具有很大的应用价值，如果能从环境中快速培养出氨氧化古菌，这将大大利于其科学研究及生产应用。目前，利用抗生素来抑制或者杀细菌是氨氧化古菌富集的常用方法，但由于细菌和古菌之间的相互作用，或细菌对抗生素的耐药性，使得高纯度氨氧化古菌的富集培养异常艰难。
技术实现思路
针对从自然环境中难以获得氨氧化古菌，培养时间过长等问题，本专利技术的目的在于提供一种从环境中快速富集Nitrosocosmicus属氨氧化古菌的方法。本专利技术利用石英砂作为氨氧化古菌的附着介质，并且以石英砂作为种子进行传代，大大缩短了从环境中得到氨氧化古菌的时间。除此之外，联用穿透生物膜能力较强的阿奇霉素与环丙沙星，快速抑制和杀灭生物膜中存在的共生细菌，在一个培养周期内使氨氧化古菌的丰度达到90％以上。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：一种从环境中快速富集Nitrosocosmicus属氨氧化古菌的方法，包括如下步骤：(1)在氨氧化古菌富集培养基中加入氨苄青霉素和卡那霉素，接种样品，并添加石英砂作为介质，开始第一阶段的定向富集培养；(2)当培养物中氨氮浓度下降至初始浓度20～30％(优选为20％)时，收集石英砂并转入新鲜氨氧化古菌富集培养基中进行传代培养；(3)传代培养中，当每克石英砂中氨氧化古菌16SrDNA拷贝数达到107～108拷贝(优选为108拷贝)时，开始第二阶段的快速纯化，即收集石英砂并转移到新鲜氨氧化古菌富集培养基中，添加阿奇霉素和环丙沙星为组合抗生素，杀灭石英砂上生物膜中的细菌并抑制纯化培养过程中细菌的生长；(4)高纯度氨氧化古菌的评价。优选的，步骤(1)中所述的样品为土壤样品。优选的，所述的石英砂为8～16目的石英砂。所述的氨氧化古菌富集培养基为：1g/LNaCl、0.4g/LMgCl2·6H2O、0.1g/LCaCl2·2H2O、0.2g/LKH2PO4、0.5g/LKCl、1mL/L微量元素(1.5g/LFeCl2·4H2O，190mg/LCoCl2·6H2O，100mg/LMnCl2·6H2O，70mg/LZnCl2，62mg/LHBO3，36mg/LNa2MoO4·2H2O，24mg/LNiCl2·6H2O，17mg/LCuCl2·2H2O)、1mL/LFe-EDTA溶液(49.14g/LFeSO4·7H2O、196.896g/LEDTANa2·4H2O)、336mg/LNaHCO3和107mg/LNH4Cl，pH为7.0。第一阶段使用的氨苄青霉素和卡那霉素在氨氧化古菌富集培养基中的浓度分别为40～60mg/L(优选为50mg/L)，添加的石英砂量为10～15％(w/v)(优选为10％)，培养条件为28～32℃(优选为30℃)黑暗静置培养。第二阶段使用的阿奇霉素和环丙沙星在氨氧化古菌富集培养基中的浓度分别为40～60mg/L(优选为50mg/L)。所述的传代培养是以石英砂作为种子，每次石英砂收集时将上清液倾倒即可。所述氨氧化古菌的评价采用绝对荧光定量PCR--标准曲线法，Nitrosocosmicus属氨氧化古菌16SrDNA特异性引物为：SS16S-1F：5′-GCGCGAAACCTCTGCAATAG-3′；SS16S-1R：5′-CCCAATAAACGTCCCGACCA-3′；用于Nitrosocosmicus属氨氧化古菌的定量，细菌16SrDNA通用引物为：1369F：5′-CGGTGAATACGTTCYCGG-3′；1492R：5′-GYYACCTTGTTACGACTT-3′。具体的，根据得到的氨氧化古菌CA和细菌CB的16SrDNA的拷贝数计算氨氧化古菌的丰度PA：石英砂质量为MS，提取的DNA溶液的体积为V1，用于定量PCR反应的DNA溶液体积为V2，以此计算石英砂上氨氧化古菌的数量QA：Nitrosocosmicus属氨氧化古菌具有在介质表面形成生物膜的特性，本专利技术将利用其成膜的能力该类型氨氧化古菌的富集培养，阐明了一种新型的氨氧化古菌富集策略，并在短时间内获得了高纯度的富集物。本专利技术相对于现有技术具有如下的优点及效果：(1)采用石英砂作为氨氧化古菌的附着基质，并且以石英砂作为传代的种子，大大减少了在传代过程中氨氧化古菌的损失，相对于目前常用的以10％～20％接种量的液体种传代方式，该方法可以将大部分培养的氨氧化古菌转移到新鲜的培养基中，明显缩短了培养的周期。(2)使用环丙沙星和阿奇霉素处理氨氧化古菌的生物膜，可以在短期内显著提高氨氧化古菌的丰度。若在传统的培养方式中使用这两种抗生素，则无法在短时间得到足够数量且高丰度的富集物。(3)培养方式简单，在没有增加技术难度的基础上，显著缩短了培养难度和时间。(4)本方法可在几个月内获得高纯度的氨氧化古菌富集物，明显缩短了氨氧化古菌富集培养所需的时间，为氨氧化古菌的研究与应用奠定了基础。附图说明图1是以石英砂为转接载体的培养过程中氨氮的消耗以及亚硝酸盐氮的积累曲线。图2是以石英砂为转接载体的培养过程中氨氧化古菌的数量和比例的变化。图3是添加环丙沙星和阿奇霉素后富集物中氨氧化古菌的数量和比例。具体实施方式下面结合实施例及附图对本专利技术作进一步详细的描述，但本专利技术的实施方式不限于此。下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为从商业途径得到的试剂和材料。实施例一：(1)接种5g土壤至含有100mL氨氧化古菌富集培养基的三角瓶内，并添加10g石英砂(8～16目)，抗生素的配方为50mg/L的卡那霉素和氨苄青霉素，30℃黑暗静置培养。当氨氮的浓度下降到初始浓度20％后，转移石英砂到新鲜的氨氧化古菌富集培养基，每3天检测一次富集物中的氨氮和亚硝酸盐氮浓度。结果如图1所示，随着传代的进行，消耗培养基中氨氮的速度明显加快培养一代的代时从最初的24天缩短到了6天，这说本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种从环境中快速富集Nitrosocosmicus属氨氧化古菌的方法，其特征在于：包括如下步骤：(1)在氨氧化古菌富集培养基中加入氨苄青霉素和卡那霉素，接种样品，并添加石英砂作为介质，开始第一阶段的定向富集培养；(2)当培养物中氨氮浓度下降至初始浓度20～30％时，收集石英砂并转入新鲜氨氧化古菌富集培养基中进行传代培养；(3)传代培养中，当每克石英砂中氨氧化古菌16S rDNA拷贝数达到10

【技术特征摘要】
1.一种从环境中快速富集Nitrosocosmicus属氨氧化古菌的方法，其特征在于：包括如下步骤：(1)在氨氧化古菌富集培养基中加入氨苄青霉素和卡那霉素，接种样品，并添加石英砂作为介质，开始第一阶段的定向富集培养；(2)当培养物中氨氮浓度下降至初始浓度20～30％时，收集石英砂并转入新鲜氨氧化古菌富集培养基中进行传代培养；(3)传代培养中，当每克石英砂中氨氧化古菌16SrDNA拷贝数达到107～108拷贝时，开始第二阶段的快速纯化，即收集石英砂并转移到新鲜氨氧化古菌富集培养基中，添加阿奇霉素和环丙沙星为组合抗生素，杀灭石英砂上生物膜中的细菌并抑制纯化培养过程中细菌的生长；(4)高纯度氨氧化古菌的评价。2.根据权利要求1所述的从环境中快速富集Nitrosocosmicus属氨氧化古菌的方法，其特征在于：步骤(1)中所述的样品为土壤样品。3.根据权利要求1所述的从环境中快速富集Nitrosocosmicus属氨氧化古菌的方法，其特征在于：所述的石英砂为8～16目的石英砂。4.根据权利要求1所述的从环境中快速富集Nitrosocosmicus属氨氧化古菌的方法，其特征在于：所述的氨氧化古菌富集培养基为：1g/LNaCl、0.4g/LMgCl2·6H2O、0.1g/LCaCl2·2H2O、0.2g/LKH2PO4、0.5g/LKCl、1mL/L微量元素、1mL/LFe-EDTA溶液、336mg/LNaHCO3和107mg/LNH4Cl，pH为7.0；所述的微量元素为1.5g/LFeCl2·4H2O，190mg/LCoCl2·6H2O，100mg/LMnCl2·6H2O，70mg/LZnCl2，62mg/LHBO3，36mg/LNa2MoO4·2H2O，24mg/LNiCl2·6H2O，17mg/LCuCl2·2H2O；所述的Fe-EDTA溶液为49.14g/LFeSO4·7H2O、196.896g/LEDTANa2·4H2O。5.根据权利要求1所述的从环境中快速富集Nitrosocos...

【专利技术属性】
技术研发人员：林炜铁，罗剑飞，刘亮霆，
申请(专利权)人：华南理工大学，
类型：发明
国别省市：广东,44