中国石竹的原位杂交方法技术

本发明专利技术属于园艺植物分子生物学方法领域，具体涉及一种中国石竹花蕾的原位杂交方法。包括以下步骤：样品的制备，RNA探针的制备，杂交前预处理，制备杂交液，预杂交，杂交和背景检测等步骤。本发明专利技术首次提供了中国石竹的原位杂交步骤，能有效消除背景干扰，提高检测灵敏度和准确性,可以较好的应用于中国石竹的遗传转化中。本发明专利技术建立的中国石竹原位杂交方法，稳定，准确，有利于对中国石竹花发育过程中基因表达模式的研究。

In situ hybridization of Dianthus chinensis

The invention belongs to the field of molecular biological methods for horticultural plants, in particular to an in-situ hybridization method for Chinese Dianthus buds. It includes the following steps: sample preparation, RNA probe preparation, pre-hybridization, preparation of hybridization solution, pre-hybridization, hybridization and background detection. The invention provides in-situ hybridization steps of Chinese Dianthus for the first time, which can effectively eliminate background interference, improve detection sensitivity and accuracy, and can be better applied to genetic transformation of Chinese Dianthus. The method of in situ hybridization of Chinese Dianthus caryophyllus established by the invention is stable and accurate, and is beneficial to the study of gene expression pattern during the development of Chinese Dianthus caryophyllus flowers.

【技术实现步骤摘要】
中国石竹的原位杂交方法
本专利技术属于园艺植物分子生物学
，具体涉及中国石竹的原位杂交方法，本专利技术主要用于石竹花蕾中目的基因表达的原位杂交的检测。
技术介绍
原位杂交(insituhybridization)是指将特定标记的已知核酸序列作为探针与细胞或组织切片中核酸进行杂交，从而对特定核酸序列进行精确定位的过程。原位杂交可以在细胞标本或组织标本上进行。该方法可以直观地反映目的基因在组织器官发育中的时空表达情况和表达的发育图式，并可用于分析目的基因在相应组织或器官形成中的作用。目前，相关植物的原位杂交取得良好进展。但是，在中国石竹(Dianthuschinensis)中原位杂交中信号灵敏度不高，背景信号太强，且杂交效率偏低，杂交时间长，着色不清晰，原有的方法难以对中国石竹原位杂交中的基因表达进行良好的检测。目前还没有一种针对中国石竹花蕾原位杂交方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术存在的上述缺陷，提供一种对中国石竹花蕾的原位杂交方法。一种检测中国石竹花发育过程中目的基因的原位杂交方法，包括如下步骤：A、中国石竹花蕾的固定及包埋：将中国石竹的花蕾用EAF固定液(参见后面的试剂配制)进行固定，再用梯度乙醇溶液对固定样品脱水，获得脱水样品；将获得的脱水样品经过梯度二甲苯和乙醇混合液进行透明，之后再通过梯度二甲苯和石蜡混合液浸蜡，最后用纯石蜡对样品进行包埋；B、RNA探针的制备：在目标基因的特异区域设计RNA探针引物，其中的反向引物包含T7启动子，其序列如SEQIDNO:1所述，然后进行体外扩增，转录和纯化，获得标记的RNA探针；C、中国石竹花蕾的原位杂交：将脱水样品进行脱蜡，复水，消化处理；将处理后的样品进行预杂交、杂交；将杂交后的样品进行封闭洗脱和信号检测；上述步骤A中的梯度乙醇溶液由无水乙醇和水组成，溶剂无水乙醇的体积依次由30％增加到100％；上述步骤A中的中国石竹花蕾的固定和包埋包括以下步骤：A1、取中国石竹的花蕾，置于EAF固定液中30min，以0.08MPa抽真空30min；A2、对中国石竹器官和组织(例如花蕾)进行脱水，用乙醇溶液30％、50％、75％、85％、95％、100％对固定样品进行脱水,每次脱水40min，得脱水样品,4℃过夜；A3、对中国石竹植物器官和组织(例如花蕾)进行透明、透蜡和包埋处理，将获得的脱水样品，按二甲苯和乙醇体积比为0:1、1:3、1:1、3:1、1:0的梯度浓度进行透明，每次处理30min，之后再经过二甲苯和石蜡体积比为0:1、1:1、1:0的梯度溶液，每次处理1h,之后用纯石蜡溶液处理3次，每次静置1h,最后用纯石蜡对样品进行包埋；上述步骤B中的RNA探针的制备包括如下步骤：B1、RNA探针的引物设计,选取基因的特异区域设计候选探针引物，候选RNA探针长度优选为150-350bp；B2、对RNA探针进行扩增及纯化,在热循环仪上进行PCR反应扩增目的片段，并用DNA纯化试剂盒进行纯化；B3、对RNA探针进行转录及纯化，转录反应体系为：10×NTPlabelingmixture2μl，5×Transcriptionbuffer2μl，ProtectorRNaseinhibitor1μl，RNAPolymeraseT72μl，PCR产物1μg，补水至20μl；混匀，离心，于37℃孕育2h；加DNaseI消化模板DNA，于37℃孕育15min，用0.2MEDTA终止反应；上述步骤C中的中国石竹花蕾的原位杂交包括以下步骤：C1、对样品进行脱蜡，复水；C2、对样品蛋白进行消化；C3、将消化后的样品再次固定；C4、预杂交和杂交；C5、将样品进行封闭和洗脱；C6、对样品进行信号检测；上述样品经过切片，脱蜡，复水处理之后进行蛋白消化；终止蛋白消化反应利用蛋白酶K混合液漂洗，再用甘氨酸溶液漂洗；所述蛋白酶K混合液为10μg/ml蛋白酶K、100mMTrisPH7.5溶液、50mMEDTA；所述甘氨酸溶液为磷酸盐缓冲液即PBS稀释20g/mL甘氨酸水溶液至2mg/mL；将消化后的植物样品再次固定，即利用3.7％甲醛PBS溶液固定10min；对再固定的样品在预杂交液中进行预杂交，在杂交液中进行杂交；所述预杂交液为1×杂交盐，50％的去离子甲酰胺，2×Denhart’s缓冲液和0.5mg/mL的tRNA混合液；所述杂交液为预杂交液和30％硫酸葡聚糖的混合物。对杂交后的样品进行封闭和洗脱；所述封闭反应需用1×blockingsolution进行封闭；所述洗脱反应，需用1×BSA0.3％TritonX-100进行洗脱。对封闭后的样品进行信号检测；进行信号检测需经过buffer2和1×BSA0.3％TritonX-100溶液漂洗，再经过buffer4显色1-2天。上述检测目的基因为Dca7718，来自中国石竹即香石竹基因组网站(http://carnation.kazusa.or.jp/)。上述方法中所述的探针的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。中国石竹遍布世界各地，香石竹作为世界四大鲜切花之一,在中国具有很高的经济价值及科研价值，中国石竹被广泛用于园林绿化。本专利技术提供的整体原位杂交方法可用于检测中国石竹中目的基因的表达情况。本专利技术的有益效果：本专利技术采用优化的固定方法和杂交方式，不但简化了操作步骤，可以两天完成固定包埋，提高了该固定方法的灵活性和可操作性，拓展了实用范围。本专利技术首次提供了中国石竹原位杂交步骤，使中国石竹的花蕾切片着色清晰、杂交信号特异性强、杂交背景低。本专利技术建立的实用、稳定的中国石竹花蕾发育的原位杂交技术，有利于对其进行基因表达模式的分析。附图说明图1：实施例1中国石竹花蕾样品的固定。图2：实施例1中RNA探针的凝胶检测。图3：中国石竹花蕾的原位杂交结果。具体实施方式对序列表的说明SEQIDNO:1是本专利技术实施例制备的RNA探针序列。SEQIDNO:2是本专利技术实施例扩增片段的正向引物序列。SEQIDNO:3是本专利技术实施例扩增片段的反向引物序列。下面通过具体实施例对本专利技术的方法进行详细说明，但本专利技术的实施方式并不局限于此。下述实施例中所述试验方法，如无特殊说明，均为常规方法。所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。所采用溶液均为常规方法灭菌、失活降解酶的去离子水配置。本专利技术样本成像观测是利用江南永新NLCD500数码生物显微镜进行。其他仪器型号和货号的相关信息信息如下所述：DIGRNALabellingmix，购自Roche公司，货号11277073910。Anti-Digoxigenin-APFabfragments，购自Roche公司，货号11093274910。DNA纯化试剂盒购自SIMGEN公司，货号2101050。下列实施例中所用部分试剂配方如下：试剂配制：a.EAF固定液：50％无水乙醇、5％冰醋酸、3.7％甲醛溶液、加超纯水定容至100ml。b.1MTris-HCl(pH7.5)：Trisbase60.55g，加水，加入浓盐酸，调PH至7.5，定容至500ml，灭菌后室温保存。c.0.5MEDTA-2Na(pH8.0)：EDTA-2Na93.06g，加超纯水，再加NaOH溶液，调pH至8.0，定容至500mL，灭菌后在室温下保存。d本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测中国石竹花蕾发育过程中目的基因的原位杂交方法，其特征在于下列步骤：A、中国石竹花蕾的固定及包埋：将中国石竹的花蕾用EAF固定液进行固定，再用梯度乙醇溶液对固定样品脱水，获得脱水样品；将获得的脱水样品经过梯度二甲苯和乙醇混合液进行透明，之后再通过梯度二甲苯和石蜡混合液浸蜡，最后用纯石蜡对样品进行包埋；B、RNA探针的制备：在目标基因的特异区域设计探针引物，其中的反向引物包含T7启动子，其序列如SEQ ID NO:1所述，然后进行体外扩增，转录和纯化，获得标记的RNA探针；C、中国石竹花蕾的原位杂交：将脱水样品进行脱蜡，复水，消化处理；将处理后的样品进行预杂交、杂交；将杂交后的样品进行封闭洗脱和信号检测；上述步骤A中的梯度乙醇溶液由无水乙醇和水组成，溶剂无水乙醇的体积依次由30％增加到100％；上述步骤A中的中国石竹花蕾的固定和包埋包括以下步骤：A1、取中国石竹的花蕾，置于EAF固定液中30min，以0.08MPa抽真空30min；A2、对中国石竹器官和组织进行脱水，用乙醇溶液30％、50％、75％、85％、95％、100％对固定样品进行脱水,每次脱水40min，得脱水样品,置于4℃过夜；A3、对中国石竹器官和组织进行透明、透蜡和包埋处理，将获得的脱水样品，按二甲苯和乙醇体积比为0:1、1:3、1:1、3:1、1:0的梯度进行透明，每次处理30min，之后再经过石蜡和二甲苯体积比为0:1、1:1、1:0梯度溶液，每次处理1h,之后用纯石蜡溶液处理3次，每次静置1h,最后用纯石蜡对样品进行包埋；上述步骤B中的RNA探针的制备包括如下步骤：B1、RNA探针的引物设计,选取基因的特异区域设计候选RNA探针引物，候选RNA探针长度优选为150‑350bp；B2、对RNA探针进行扩增及纯化,在热循环仪上进行PCR反应扩增目的片段，并用DNA纯化试剂盒进行纯化；B3、对RNA探针进行转录及纯化，转录反应体系为：10×NTP labeling mixture 2μl，5×Transcription buffer 2μl，Protector RNase inhibitor 1μl，RNA Polymerase T7 2μl，PCR产物1μg，补水至20μl；混匀，离心，于37℃孕育2h；加DNaseI消化模板DNA，于37℃孕育15min，用0.2M EDTA终止反应；上述步骤C中的中国石竹花蕾的原位杂交包括以下步骤：C1、对样品进行脱蜡，复水；C2、对样品蛋白进行消化；C3、将消化后的样品再次固定；C4、预杂交和杂交；C5、将样品进行封闭和洗脱；C6、对样品进行信号检测；上述样品经过切片，脱蜡，复水处理之后进行蛋白消化；终止蛋白消化反应利用蛋白酶K混合液漂洗，再用甘氨酸溶液漂洗；所述蛋白酶K混合液的配制为10μg/ml蛋白酶K、100mM Tris PH7.5溶液、50mM EDTA；所述甘氨酸溶液配制为磷酸盐缓冲液即PBS稀释20g/mL甘氨酸水溶液至2mg/mL；将消化后的中国石竹样品再次固定，即利用3.7％甲醛PBS溶液固定10min；对再固定的样品在预杂交液中进行预杂交，在杂交液中进行杂交；所述预杂交液配制为1×杂交盐，50％的去离子甲酰胺，2×Denhart’s缓冲液和0.5mg/mL的tRNA混合液；所述的杂交液为预杂交液和30％硫酸葡聚糖的混合物；对杂交后的样品进行封闭和洗脱；所述封闭反应需用1×blocking solution进行封闭；所述洗脱反应，需用1×BSA 0.3％Triton X‑100进行洗脱；对封闭后的样品进行信号检测；进行信号检测需经过buffer2和1×BSA 0.3％Triton X‑100溶液漂洗，再经过buffer4显色1‑2天。...

【技术特征摘要】
1.一种检测中国石竹花蕾发育过程中目的基因的原位杂交方法，其特征在于下列步骤：A、中国石竹花蕾的固定及包埋：将中国石竹的花蕾用EAF固定液进行固定，再用梯度乙醇溶液对固定样品脱水，获得脱水样品；将获得的脱水样品经过梯度二甲苯和乙醇混合液进行透明，之后再通过梯度二甲苯和石蜡混合液浸蜡，最后用纯石蜡对样品进行包埋；B、RNA探针的制备：在目标基因的特异区域设计探针引物，其中的反向引物包含T7启动子，其序列如SEQIDNO:1所述，然后进行体外扩增，转录和纯化，获得标记的RNA探针；C、中国石竹花蕾的原位杂交：将脱水样品进行脱蜡，复水，消化处理；将处理后的样品进行预杂交、杂交；将杂交后的样品进行封闭洗脱和信号检测；上述步骤A中的梯度乙醇溶液由无水乙醇和水组成，溶剂无水乙醇的体积依次由30％增加到100％；上述步骤A中的中国石竹花蕾的固定和包埋包括以下步骤：A1、取中国石竹的花蕾，置于EAF固定液中30min，以0.08MPa抽真空30min；A2、对中国石竹器官和组织进行脱水，用乙醇溶液30％、50％、75％、85％、95％、100％对固定样品进行脱水,每次脱水40min，得脱水样品,置于4℃过夜；A3、对中国石竹器官和组织进行透明、透蜡和包埋处理，将获得的脱水样品，按二甲苯和乙醇体积比为0:1、1:3、1:1、3:1、1:0的梯度进行透明，每次处理30min，之后再经过石蜡和二甲苯体积比为0:1、1:1、1:0梯度溶液，每次处理1h,之后用纯石蜡溶液处理3次，每次静置1h,最后用纯石蜡对样品进行包埋；上述步骤B中的RNA探针的制备包括如下步骤：B1、RNA探针的引物设计,选取基因的特异区域设计候选RNA探针引物，候选RNA探针长度优选为150-350bp；B2、对RNA探针进行扩增及纯化,在热循环仪上进行PCR反应扩...

【专利技术属性】
技术研发人员：傅小鹏，张晓妮，包满珠，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42