一种环糊精糖基转移酶在生产α-糖基橙皮苷中的应用制造技术

技术编号:20931798 阅读:36 留言:0更新日期:2019-04-20 13:26
本发明专利技术公开了一种环糊精糖基转移酶在生产α‑糖基橙皮苷中的应用,本发明专利技术构建的生产α‑糖基橙皮苷的菌剂的活性成分为大肠杆菌IEF‑cgt02,能够在胞内高效合成热稳定性环糊精葡萄糖基转移酶,以糊精为糖基供体,高效催化对橙皮苷的糖基化反应;本发明专利技术的菌剂生物催化生产2‑15%的α‑糖基橙皮苷,反应24小时以内,橙皮苷的转化率在70%以上,具有底物投料量高、催化速率快、底物转化率高的特点,适用于工业化生产α‑糖基橙皮苷。

Application of a Cyclodextrin Glycosyltransferase in the Production of Alpha-Glycosylhesperidin

The invention discloses the application of cyclodextrin glycosyltransferase in the production of alpha-glycosylhesperidin. The active ingredient of the bacterial agent for the production of alpha-glycosylhesperidin is Escherichia coli IEF_cgt02, which can efficiently synthesize thermostable cyclodextrin glycosyltransferase in cells and efficiently catalyze the glycosylation reaction of hesperidin with dextrin as a sugar donor. The conversion of hesperidin is over 70% within 24 hours. It is suitable for industrial production of alpha-glycosyl hesperidin because of its high feed rate, fast catalytic rate and high conversion of substrates.

【技术实现步骤摘要】
一种环糊精糖基转移酶在生产α-糖基橙皮苷中的应用(一)
本专利技术涉及一种环糊精糖基转移酶在生产α-糖基橙皮苷中的应用。(二)
技术介绍
橙皮苷(Hesperidin)又名橘皮苷、橘皮甙,是橙皮素与芸香糖形成的糖苷.为二氢黄酮衍生物。广泛存在于豆科、唇花科、碟形花科、芸香科柑橘属植物中,具有维持血管正常渗透压、降低血管脆性、增强毛细血管韧性、缩短出血时间等作用。橙皮苷不仅具有降低人体内胆固醇作用,还有抗病毒、提高免疫力的功效,具有消炎、抗氧化、抗菌、抗癌、防辐射、保护心血管系统等药理活性。橙皮苷水溶性较差,且具有苦味,极大限制了其应用。通过糖基化修饰,其水中溶解度可提高50倍以上,极大改善其溶解性,从提高橙皮苷的应用范围和使用效果。目前关于橙皮苷的改性,主要分为化学改性和生物酶法改性。虽然酶专一性强,条件温和,无“三废”产生,已有一些环糊精糖基转移酶被报道用于改性橙皮苷,但相关的专利保护的方法并不多,可能是由于这些酶法转化速率不高、底物转化率偏低等原因。随着生物信息学、基因工程技术和基因人工合成技术的不断发展,通过基因数据库搜索、人工合成并高效表达橙皮苷糖苷转移酶已成为有效的方法。我们前期研究,筛选并确定一个热稳定性环糊精糖基转移酶,具有较高的催化活性,将该基因在大肠杆菌中的过量表达,用于橙皮苷高效糖基化修饰,具有工业应用前景。(三)
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种环糊精糖基转移酶在生产α-糖基橙皮苷中的应用。本专利技术采用的技术方案是:本专利技术提供一种源自热硫嗜热厌氧杆菌(Thermoanaerobacteriumthermosulfurigenes)的环糊精糖基转移酶在生产α-糖基橙皮苷中的应用,所述环糊精糖基转移酶氨基酸序列为SEQIDNO.2所示,所述酶编码基因的核苷酸序列为SEQIDNO.1所示。进一步,所述的应用以含环糊精糖基转移酶编码基因的工程菌经发酵培养获得的发酵液经破碎后的混合液为菌剂,以橙皮苷和糊精为底物,以水为反应介质构成转化体系,在pH值5.0-8.0、65-85℃条件下进行转化反应(优选10-24h),反应完全后,将反应液分离纯化,获得α-糖基橙皮苷。所述转化体系中,橙皮苷质量加入量为20-150g/L(优选100g/L),所述糊精质量加入量为100-500g/L(优选400g/L),所述菌剂用量以破碎前发酵液中湿菌体重量计,所述转化体系中湿菌体含量为5-30g/L(优选15g/L),所述NaOH水溶液体积用量以橙皮苷质量计为2-20ml/g。进一步,所述反应优选在pH值6.0、75℃条件下进行转化反应。进一步,本专利技术所述菌剂按如下方法制备:将含环糊精糖基转移酶编码基因的工程菌接种到含卡那霉素100μg/mL发酵培养基中,30-37℃培养4-6h(优选35℃、5h);再加入终浓度为5.6-7.0mM(优选7.0mM)的α-乳糖,补加30g/L的甘油,22-25℃继续发酵12-18h(优选22℃、12h),取发酵液经高压破碎,取混合液,即得到生产α-橙皮苷的菌剂;所述发酵培养基组成:12g/L蛋白胨、10g/L酵母粉、Na2HPO4·12H2O8.9g/L、KH2PO43.4g/L、NH4Cl2.67g/L、Na2SO40.71g/L、MgSO4·7H2O0.3g/L,溶剂为去离子水,pH7.0。进一步,所述工程菌在发酵前先进行种子活化培养,再将种子液以体积浓度1-5%(优选2%)的接种量接种至发酵培养基,所述种子活化培养为:将含环糊精糖基转移酶编码基因的工程菌(优选大肠杆菌IFE-cgt02)接种在含有35μg/ml氯霉素和100μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中,37℃培养至对数生长中期,获得种子液;所述LB液体培养基组成:酵母粉5.0g/L、蛋白胨10.0g/L、NaCl10.0g/L,溶剂为去离子水,pH值自然。进一步,本专利技术所述含环糊精糖基转移酶编码基因的工程菌按如下方法构建:将SEQIDNO.1所示环糊精糖基转移酶编码基因cgt02克隆至质粒pET28a,构建重组表达质粒pET28a-cgt02,导入E.coliRosettaTM(DE3)感受态细胞,筛选获得含重组质粒pET28a-cgt02的阳性克隆子E.coliRosettaTM(DE3)(pET28a-cgt02),记为大肠杆菌(Escherichiacoli)IFE-cgt02。与现有技术相比,本专利技术有益效果主要体现在:(1)本专利技术构建的生产α-糖基橙皮苷的菌剂的活性成分为大肠杆菌(Escherichiacoli)IEF-cgt02,能够在胞内高效合成热稳定性环糊精葡萄糖基转移酶,以糊精为糖基供体,高效催化对橙皮苷的糖基化反应;(2)本专利技术的菌剂生物催化生产2-15%的α-糖基橙皮苷,反应24小时以内,橙皮苷的转化率在70%以上,(而CN102051397A描述的转化率为52.5%)具有底物投料量高、催化速率快、底物转化率高的特点,适用于工业化生产α-糖基橙皮苷。(四)附图说明图1α-单葡萄糖基橙皮苷的结构示意图。图2为pET22b-cgt02载体的结构示意图。(五)具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术进行进一步描述,但本专利技术的保护范围并不仅限于此:下述实施例中如无特殊说明所用方法均为常规方法,所用试剂均可从商业途径获得。LB液体培养基:酵母粉5.0g/L、蛋白胨10.0g/L、NaCl10.0g/L,溶剂为去离子水,pH值自然。LB培养基:酵母粉5.0g/L、蛋白胨10.0g/L、NaCl10.0g/L,琼脂20g/L,溶剂为去离子水,pH值自然。发酵培养基:12g/L蛋白胨、10g/L酵母提取粉、8.9g/LNa2HPO4·12H2O、15g/L乳糖、3.4g/LKH2PO4、2.67g/LNH4Cl、0.71g/LNa2SO4、0.3g/LMgSO4·7H2O,溶剂为去离子水,pH值自然。实施例1、制备生产α-糖基橙皮苷的菌剂一、构建高效表达热稳定性环糊精糖基转移酶的大肠杆菌参考NCBI数据库报道的热硫嗜热厌氧杆菌(Thermoanaerobacteriumthermosulfurigenes)(NCBI登入号NO.P26827.2),将序列发给基因合成公司(无锡青兰生物科技有限公司),要求对其进行密码子优化,人工合成环糊精糖基转移酶编码基因cgt02(核苷酸序列为SEQIDNO.1所示,氨基酸序列为SEQIDNO.2所示),并克隆到表达载体pET22b的NcoI/HindIII之间,获得重组质粒pET22b-cgt02。重组质粒pET22b-cgt02的转化方法如下:取5μL重组质粒pET22b-cgt02,加入到100μL的E.coliRosettaTM(DE3)感受态细胞中,轻弹管壁数下混匀,在冰水浴中放置30min。42℃热激90s,冰水孵育3min。加入800μLLB培养基,37℃孵育45min使其抗性复苏。9000rpm离心2min,将菌体浓缩至100μL,均匀涂布在含有35μg/ml氯霉素和100μg/ml氨苄青霉素的LB平板上。将平板倒置,于37℃过夜培养。阳性克隆转化子的鉴定。在长有重组子的平板上,直接挑取6个单菌落含有35μg/ml氯霉素和100μg/ml氨苄青霉素的LB液本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种源自热硫嗜热厌氧杆菌(Thermoanaerobacteriumthermosulfurigenes)的环糊精糖基转移酶在生产α‑糖基橙皮苷中的应用。

【技术特征摘要】
1.一种源自热硫嗜热厌氧杆菌(Thermoanaerobacteriumthermosulfurigenes)的环糊精糖基转移酶在生产α-糖基橙皮苷中的应用。2.如权利要求1所述的应用,其特征在于所述环糊精糖基转移酶氨基酸序列为SEQIDNO.2所示。3.如权利要求1所述的应用,其特征在于所述环糊精糖基转移酶编码基因的核苷酸序列为SEQIDNO.1所示。4.如权利要求1所述的应用,其特征在于所述的应用以含环糊精糖基转移酶编码基因的工程菌经发酵培养获得的发酵液经破碎后的混合液为菌剂,以橙皮苷和糊精为底物,以水为反应介质构成转化体系,在pH值5.0-8.0、65-85℃条件下进行转化反应,反应完全后,将反应液分离纯化,获得α-糖基橙皮苷;所述橙皮苷先溶于1mol/LNaOH水溶液中制成溶液后加入转化体系。5.如权利要求1所述的应用,其特征在于所述转化体系中,橙皮苷加入的质量浓度为20-150g/L,所述糊精加入的质量浓度为100-500g/L;所述菌剂用量以破碎前发酵液中湿菌体重量计,所述转化体系中湿菌体含量为5-30g/L;所述NaOH水溶液体积用量以橙皮苷质量计为2-20ml/g。6.如权利要求1所述的应用,其特征在于...

【专利技术属性】
技术研发人员:陈小龙许敏朱林江陆跃乐范永仙
申请(专利权)人:浙江工业大学
类型:发明
国别省市:浙江,33

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