一种应用Perakine还原酶合成手性醇的方法技术

本发明专利技术公开了一种应用Perakine还原酶合成手性醇的方法，以不同的潜手性酮为底物，经Perakine还原酶催化体系还原合成手性醇，所述催化体系由Perakine还原酶和辅酶再生系统组成。本发明专利技术中所述应用Perakine还原酶作为催化剂合成手性醇的方法不仅具有反应步骤简单、反应条件温和、环境友好、催化效率高、酶纯化简单、稳定性好、立体选择性强等优点，而且Perakine还原酶的底物性极广，其底物包括苯乙酮类、烯酮类、环状酮及链状酮等，在手性醇及相关手性药物的工业合成领域具有良好的工业应用开发前景。

A Method for the Synthesis of Chiral Alcohols by Perakine Reductase

The invention discloses a method for synthesizing chiral alcohols by using Perakine reductase, which uses different latent Chiral Ketones as substrates and is reduced to synthesize chiral alcohols by Perakine reductase catalytic system, which is composed of Perakine reductase and coenzyme regeneration system. The method of synthesizing chiral alcohols by using Perakine reductase as catalyst not only has the advantages of simple reaction steps, mild reaction conditions, friendly environment, high catalytic efficiency, simple enzyme purification, good stability and strong stereoselectivity, but also has a wide range of substrates, including acetophenones, ketones, cyclic ketones and chain ketones. The industrial synthesis of sex alcohols and related chiral drugs has good prospects for industrial application and development.

【技术实现步骤摘要】
一种应用Perakine还原酶合成手性醇的方法
本专利技术属于生物化工
，具体地说，是应用Perakine还原酶为催化剂不对称还原潜手性酮获得光学醇的手性醇的方法。
技术介绍
手性醇是一类极为重要的精细化工和手性药物合成的中间体，其合成一直以来备受研究者的关注。目前主要应用化学和生物催化剂以不氢对称转移反应(ATH)和不对称氢化(AH)的方式催化前手性酮获得手性醇。相较于化学催化，生物催化拥有高效环保的特点，更符合目前倡导的“绿色化学”的发展趋势。生物催化方式主要包括全细胞催化、粗酶液催化和纯酶催化，其中以纯酶作为生物催化剂均具有后处理简单、副反应少的优点，而较受青睐。目前可应用于不对称还原酮的酶主要有短链脱氢酶和酮还原酶，但由于受到稳定性、底物谱、催化效率及酶产量等多种因素的限制，而无法广泛应用于手性醇的合成，因此研究者们仍在不断寻找新的可以用于手性醇合成的酮还原酶。Perakine还原酶(PerakineReductase)来源于夹竹桃科萝芙木属药用植物蛇根木(RauvolfiaserpentinaBenth.exKurz)，为醛酮还原酶(Aldo-KetoReductase，AKR)超家族的成员，以NADPH为辅酶催化醛酮还原反应(SunL,RuppertM,SheludkoY,WarzechaH,ZhaoY,J.Purification,cloning,functionalexpressionandcharacterizationofperakinereductase:thefirstexamplefromtheAKRenzymefamily,extendingthealkaloidalnetworkoftheplantRauvolfia.PlantMolBiol.2008,67(5):455-67.)。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供一种应用Perakine还原酶合成手性醇的方法。该方法具有立体选择性好、转化效率高、反应步骤简单，可转化的潜手性酮类型多样等特点。本专利技术提供的一种应用Perakine还原酶合成手性醇的方法，以潜手性酮为底物，经酶催化体系催化获得相应的手性醇，所述酶催化体系由Perakine还原酶和辅酶再生系统组成。具体步骤为：以潜手性酮为原料，以NADPH为辅酶，在Perakine还原酶的不对称催化下，还原生成相应的手性醇，反应式如下：在反应过程中NADPH被氧化成NADP+，但NADPH价格昂贵，因此需要辅酶再生系统将NADP+再生为NADPH。具体的，Perakine还原酶来源于植物蛇根木(RauvolfiaserpentinaBenth.exKurz)，其氨基酸序列如序列表中PR-AA(SEQ.No.2)所示。任何对PR-AA所示氨基酸序列中氨基酸经过缺失、插入或替换一个或几个氨基酸且具有Perakine还原酶活性的，仍属于本专利技术的保护范围。具体的，编码Perakine还原酶基因的核苷酸序列如序列表中PR-DNA(SEQ.No.1)所示；如本领域技术人员所知，本专利技术的Perakine还原酶基因的核苷酸序列也可以是编码序列表中PR-AA所示的氨基酸序列组成的蛋白质的其他任何核苷酸序列。任何对PR-AA所示核苷酸序列进行一个或多个核苷酸的取代、确实或插入处理获得的核苷酸序列，只要其与核苷酸具有90％以上的同源性，均属于本专利技术的保护范围。本专利技术中，所述辅酶再生系统为：以葡萄糖脱氢酶为辅酶再生酶、以葡萄糖为辅酶再生底物、包含NADPH和NADP+的葡萄糖脱氢酶辅酶再生系统。本专利技术所述酶催化体系包括Perakine还原酶、葡萄糖脱氢酶、葡萄糖和微量NADP+。向该酶反应体系加入潜手性酮，在控制pH和温度的条件下，该酶催化体系可以将潜手性酮转化为对应的手性醇。反应原理如附图1所示。所述酶催化体系中Perakine还原酶和辅酶再生酶均纯化后为游离纯酶。作为优选，所述葡萄糖脱氢酶来源于巨大芽孢杆菌。具体的，所述葡萄糖脱氢酶来源于巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)IAM1030的葡萄糖脱氢酶。作为优选，催化体系中，所述Perakine还原酶和葡萄糖脱氢酶的添加量均为0.1～3mg/ml。催化体系中，底物潜手性酮的添加量为0.1～20mM；辅酶再生底物的添加量为0.15～30mM。作为优选，酶催化体系中，反应温度为20～55℃，反应时间为0.5～24h；更优选，温度为30～40℃，时间为2～10h。作为优选，控制反应的pH值为6～9，采用氢氧化钠来控制pH的下降，采用甲酸来控制pH的上升。所述Perakine还原酶的潜手性酮底物和手性醇产物的结构分别具有以下通式(I)和(II)，R1和R2为不同的基团。进一步，所述Perakine还原酶的潜手性酮底物包括且并不仅限于以下化合物：苯乙酮(1)、4’-硝基苯乙酮(2)、4’-氯苯乙酮(3)、4’-溴苯乙酮(4)、4’-甲氧基苯乙酮(5)、2’-溴苯乙酮(6)、3’-溴苯乙酮(7)、3’-氨基苯乙酮(8)、2-氯苯乙酮(9)、2,2’,4’-三氯苯乙酮(10)、(E)-4-苯基-3-丁烯-2-酮(11)、(E)-4-(4-硝基-苯基)-3-丁烯-2-酮(12)、(E)-4-(4-甲氧基-苯基)-3-丁烯-2-酮(13)、(E)-4-(2,4-二氯-苯基)-3-丁烯-2-酮(14)、(E)-4-(3-溴苯基)-3-丁烯-2-酮(15)、(E)-4-(3-氧代丁-1-烯-1-基)苄腈(16)、(E)-4-(2-呋喃基)-3-丁烯-2-酮(17)、(E)-4-(苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)-3-丁烯-2-酮(18)、4-苯基-2-丁酮(19)、(E)-4-(4-羟基苯基)-2-丁酮(20)、1-苯基-2,3-二酮(21)、丙酮酸乙酯(22)、2-戊酮(23)、4-甲基-2-戊酮(24)、3-甲基环己酮(25)，结构式如下：本专利技术的有益效果主要体现在：提供了一种以Perakine还原酶作为生物催化剂通过不对称还原潜手性酮合成高光学纯手性醇的方法，目前尚未见报道；与其他酮还原酶催化体系比，本专利技术中所述的Perakine还原酶催化体系具有以下显著特点，底物适应性极强、催化效率高、立体选择性高、稳定性好、易于制备，同时也具备反应条件温和、环境友好等生物催化的优势，极具工业化应用开发前景。附图说明图1为本专利技术方法所采用的Perakine还原酶体系中以葡萄糖脱氢酶再生辅酶合成手性醇的反应式。图2为纯化后Perakine还原酶SDS-PAGE图。图3为纯化后葡萄糖脱氢酶SDS-PAGE图。图4为4-硝基苯乙酮空白对照及经Perakine还原酶催化体系反应10h后反应液高效液相色谱图。图5为Perakine还原酶催化体系反应产物对硝基苯乙醇手性拆分色谱图。具体实施方式以下结合具体实施例，对本专利技术做进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本专利技术而非用于限制本专利技术的范围。本专利技术中的实验方法如无特别说明均为常规方法。本专利技术中质粒提取试剂盒购自Axygen杭州有限公司；E.coliM15、质粒pQE-2购自Qiagen公司；E.coliDH5α、E.coliBL(DE3)购自Novagen公司；预染蛋白Maker购于Fermanta本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种应用Perakine还原酶合成手性醇的方法，其特征在于，以潜手性酮为底物，经酶催化体系催化获得相应的手性醇，所述酶催化体系由Perakine还原酶和辅酶再生系统组成。

【技术特征摘要】
1.一种应用Perakine还原酶合成手性醇的方法，其特征在于，以潜手性酮为底物，经酶催化体系催化获得相应的手性醇，所述酶催化体系由Perakine还原酶和辅酶再生系统组成。2.根据权利要求1所述的一种应用Perakine还原酶合成手性醇的方法，其特征在于，通过以下步骤实现：以潜手性酮为原料，以NADPH为辅酶，在酶催化体系中Perakine还原酶的不对称催化下，还原生成相应的手性醇，反应式：在反应过程中NADPH被氧化成NADP+，通过辅酶再生系统将NADP+再生为NADPH。3.根据权利要求1或2所述的一种应用Perakine还原酶合成手性醇的方法，其特征在于，Perakine还原酶来源于植物蛇根木(RauvolfiaserpentinaBenth.exKurz)，其氨基酸序列如SEQ.No.2所示，编码Perakine还原酶基因的核苷酸序列如SEQ.No.1所示。4.根据权利要求1或2所述的一种应用Perakine还原酶合成手性醇的方法，其特征在于，所述辅酶再生系统为：以葡萄糖脱氢酶为辅酶再生酶、以葡萄糖为辅酶再生底物、包含NADPH和NADP+的葡萄糖脱氢酶辅酶再生系统。5.根据权利要求1或2所述的一种应用Perakine还原酶合成手性醇的方法，其特征在于，所述酶催化体系包括Perakine还原酶、葡萄糖脱氢酶、葡萄糖和微量NADP+，所述酶催化体系中Perakine还原酶和辅酶再生酶均纯化后为游离纯酶。6.根据权利要求5所述的一种应用Perakine还原酶合成手性醇的方法，其特征在于，所述葡萄糖脱氢酶来源于巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙莲莉，陈媛媛，邵娜娜，周韵，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33