一种提取金黄色葡萄球菌质粒的方法技术

本发明专利技术公开了一种提取金黄色葡萄球菌质粒的方法。该方法包括如下步骤：先用裂解细菌菌体的试剂、溶菌酶和葡萄球菌酶裂解细菌菌体，并采用玻璃粉进行物理破壁，使金黄色葡萄球菌菌体充分裂解，得到菌体裂解液；然后向所述菌体裂解液中加入用于沉淀蛋白质和基因组DNA的试剂，得到含有蛋白质沉淀和基因组DNA沉淀的混合液；高速离心分离，取上清液转移至吸附柱中，进行吸附离心，富集质粒DNA；加入漂洗液进行脱盐离心，加入超纯水洗脱离心，得到质粒DNA。本发明专利技术的方法同时采用物理和化学方法提高了金黄色葡萄球菌的破壁效率，节约成本，提高了质粒提取过程中质粒的回收率。

A Method for Extracting Staphylococcus aureus Plasmid

The invention discloses a method for extracting Staphylococcus aureus plasmid. The method comprises the following steps: firstly, bacterial bacteria are lysed by lysozyme, lysozyme and staphylococcal enzyme, and then the wall is physically broken by glass powder to fully lyse Staphylococcus aureus and obtain bacterial lysate; secondly, reagents for precipitating protein and genomic DNA are added to the bacterial lysate to obtain protein precipitation and genomic D. NA precipitation mixture; high-speed centrifugation separation, supernatant transfer to the adsorption column, adsorption centrifugation, enrichment of plasmid DNA; adding rinse solution for desalination centrifugation, adding ultra-pure water to wash away from the heart, to obtain plasmid DNA. The method of the invention simultaneously adopts physical and chemical methods to improve the wall-breaking efficiency of Staphylococcus aureus, save cost and improve the recovery rate of plasmids in the process of plasmid extraction.

【技术实现步骤摘要】
一种提取金黄色葡萄球菌质粒的方法
本专利技术涉及分子生物学领域，具体地涉及一种提取金黄色葡萄球菌质粒的方法。
技术介绍
质粒是染色体外能够进行自主复制的遗传单位。一般包括超螺旋、开环和线性三种结构，以环状构型为主，存在于许多细菌以及酵母菌等生物中，乃至于植物的线粒体等细胞器中。质粒的长度一般在2-20kbp，分子量一般在106以上。质粒DNA是基因工程最常见的运载体。有些质粒含有某种抗药基因，有一些质粒携带的基因可以赋予细胞额外的生理代谢能力，乃至于在一些细菌中提高它的致病力。它可以把一个有用的目的DNA片段通过重组DNA技术，送进受体细胞中去进行繁殖和表达，且一般来说，质粒的存在与否对宿主细胞生存没有决定性的作用。因此质粒提取的质量对后续的分子生物学实验的成果与否起着关键的作用。目前，市面上可购买到的质粒提取试剂盒主要都是针对革兰氏阴性菌中质粒的抽提，对于革兰氏阳性菌尤其是金黄色葡萄球菌中质粒的抽提并没有专用的试剂盒。但是金黄色葡萄球菌作为重要的病原菌，可引起许多严重的感染，若其中存在抗性质粒则会对动物甚至人类造成巨大危害。
技术实现思路
为了克服现有技术的上述缺点与不足，本专利技术的目的在于提出一种对金黄色葡萄球菌质粒进行提取的方法，基于已有的质粒提取试剂盒中化学破壁裂解方法，将化学和物理裂解方法相结合，并对整个金黄色葡萄球质粒提取流程进行优化，达到基于现在市面上已有的质粒提取试剂盒能成功将金黄色葡萄球菌中的质粒抽提出来，用于进一步的研究。本专利技术的目的通过如下技术方案实现。本专利技术提供的一种金黄色葡萄球菌的质粒提取方法，包括如下步骤：（1）将含目的质粒的金黄色葡萄球菌接种于脑心浸出液（BHI）/抗生素培养基中，摇床培养，扩增菌液，得到初级菌液；（2）接种步骤（1）所述的初级菌液至100-150mL脑心浸出液（BHI）/抗生素培养基中，接种量为1-3mL，摇床培养，扩增菌液，得到次级菌液；（3）将60mL-100mL步骤（2）所述的次级菌液进行常温离心分离；离心后倒弃上层培养液，把离心管反扣于吸水纸上吸尽残液，得到装有金黄色葡萄球菌沉淀的离心管；（4）将溶菌酶和溶葡萄球菌酶加入到裂解细菌菌体的试剂中；得到裂解金黄色葡萄球菌的混合液；（5）将步骤（4）所述裂解金黄色葡萄球菌的混合液加入到步骤（3）所述装有金黄色葡萄球菌沉淀的离心管中，涡旋重悬处理至菌体全部重悬、离心管中无沉淀为止，然后恒温浴处理，得到重悬液；（6）将500-520微升步骤（5）所述的重悬液转移至另一个离心管中，加入玻璃粉，涡旋混匀得到含玻璃粉的重悬液；（7）将碱裂解液加入步骤（6）所述含玻璃粉的重悬液中，盖上离心管盖子，颠倒离心管5-10次，得到混合液；（8）将蛋白酶K加入到步骤（7）所述混合液中，盖上离心管盖子，颠倒离心管5-10次，然后室温静置10-15分钟，其间每隔2-3分钟颠倒混匀5-10次得到含蛋白酶K的混合液；（9）将420-450微升快速沉淀缓冲液加入到步骤（8）所述含蛋白酶K的混合液中，盖上离心管的盖子，颠倒10-15次，得到悬浊液；（10）将步骤（9）得到的悬浊液进行常温离心分离，得到上清液；（11）分别将吸附柱置于收集管中，分别将步骤（10）所得上清液加入吸附柱中，常温离心分离，倒弃收集管中的滤液，将吸附柱套回收集管中；（12）将漂洗液1于吸附柱中，常温静置3-5分钟，常温离心分离，倒弃滤液，把吸附柱套回收集管中；（13）将漂洗液2于吸附柱中，常温离心分离，倒弃滤液，把吸附柱套回收集管中；（14）重复步骤（13）；（15）常温离心步骤（14）所得的吸附柱；（16）将离心后的吸附柱套在已灭菌的容积为1.5mL离心管中，将洗脱缓冲液或者灭菌水加入吸附柱的膜中央，静置后常温离心处理，弃去吸附柱，在容积为1.5mL的离心管中得到洗脱液，洗脱液中含有所述目的质粒；（17）将步骤（16）所述洗脱液转移至步骤（15）的另一个吸附柱中进行洗脱，静置后常温离心处理，弃去吸附柱，在容积为1.5mL的离心管中得到二次洗脱液，二次洗脱液中含有浓度增大的目的质粒；（18）以此类推直至所有吸附柱洗脱完全，得到最终洗脱液，即富集目的质粒DNA的洗脱液（含高纯度目的质粒DNA的洗脱液）；（19）将步骤（18）中所述富集目的质粒DNA的洗脱液（含高纯度质粒DNA的洗脱液）保存于冰箱中冷藏保存。进一步地，步骤（1）中所述目的质粒为野生型质粒，所述目的质粒含有抗-抗生素的基因；所述摇床培养的温度为37℃，培养的时间为10-12小时。进一步地，步骤（1）中所述目的质粒为野生型质粒，所述目的质粒含有抗-抗生素的基因；步骤（1）中所述摇床培养的温度为37℃，摇床培养的时间为10-12小时；步骤（2）中所述初级菌液的用量为1-3mL，即接种量为1-3mL；步骤（2）中所述脑心浸出液/抗生素培养基的用量为100-150mL；步骤（2）中所述摇床培养的温度为37℃，培养时间为12-16小时。进一步地，步骤（3）中所述次级菌液的体积为60mL-100mL；步骤（3）中所述常温离心分离的速率为6000-8000转/分钟，离心分离的时间为10-15分钟。进一步地，步骤（4）中所述溶菌酶的加入量为每毫升裂解细菌菌体的试剂中添加5-8mg；所述溶葡萄球菌酶的加入量为每毫升裂解细菌菌体的试剂中添加1-3mg。进一步地，步骤（5）中所述解金黄色葡萄球菌的混合液的加入量为3-5mL；步骤（5）中所述恒温浴处理的温度为37摄氏度；恒温浴处理的时间为20-30分钟；进一步地，步骤（6）中所述重悬液的用量为500-520微升；步骤（6）中所述玻璃粉的粒径为0.1-0.6mm，所述玻璃粉使用前需高温灭菌，所述玻璃粉的加入量为180-200mg；步骤（6）中所述涡旋混匀的涡旋时间为8-10分钟，涡旋混匀的涡旋速率为2600-2800转/分钟；步骤（7）中所述碱裂解液的加入量为500-520微升。进一步地，步骤（8）中所述蛋白酶K为一种从白色念珠菌分离出来的强力蛋白溶解酶；蛋白酶K的浓度为20-25mg/mL，蛋白酶K的加入量为10-12微升。进一步地，步骤（9）中所述快速沉淀缓冲液的加入量为420-450微升；步骤（10）中所述常温离心分离的速率为12000-13000转/分钟，常温离心分离的时间为10-15分钟；步骤（11）中所述常温离心分离的速率为8000-10000转/分钟，常温离心分离的时间为30-60秒。进一步地，步骤（11）所述吸附柱与收集管是一对一的数量关系，本专利技术提供的提取方法优选6个吸附柱与6个收集管。进一步地，步骤（12）中所述漂洗液1的加入量为600-630微升；步骤（12）中所述常温静置的时间为3-5分钟；步骤（12）中所述常温离心分离的速率为8000-10000转/分钟，常温离心分离的时间为30-60秒；步骤（13）中所述漂洗液2的加入量为620-650微升；步骤（13）中所述常温离心分离的速率为8000-10000转/分钟，常温离心分离的时间为30-60秒。进一步地，步骤（15）中所述常温离心的离心转速为12000-13000转/分钟，离心的时间为3-5分钟；步骤（16）中所述洗脱缓冲液或者灭菌水的加入量为60-100微升；步骤（16）与步骤（17）所述静置的时本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种提取金黄色葡萄球菌质粒的方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）将含目的质粒的金黄色葡萄球菌接种于脑心浸出液/抗生素培养基中，摇床培养，扩增菌液，得到初级菌液；（2）接种步骤（1）所述的初级菌液至脑心浸出液/抗生素培养基中，摇床培养，扩增菌液，得到次级菌液；（3）将步骤（2）所述的次级菌液进行常温离心分离；离心后倒弃上层培养液，把离心管反扣于吸水纸上吸尽残液，得到装有金黄色葡萄球菌沉淀的离心管；（4）将溶菌酶和溶葡萄球菌酶加入到裂解细菌菌体的试剂中；得到裂解金黄色葡萄球菌的混合液；（5）将步骤（4）所述裂解金黄色葡萄球菌的混合液加入到步骤（3）所述装有金黄色葡萄球菌沉淀的离心管中，涡旋重悬处理至菌体全部重悬、离心管中无沉淀为止，然后恒温浴处理，得到重悬液；（6）将步骤（5）所述的重悬液转移至另一个离心管中，加入玻璃粉，涡旋混匀得到含玻璃粉的重悬液；（7）将碱裂解液加入步骤（6）所述含玻璃粉的重悬液中，盖上离心管盖子，颠倒离心管5‑10次，得到混合液；（8）将蛋白酶K加入到步骤（7）所述混合液中，盖上离心管盖子，颠倒离心管5‑10次，然后室温静置10‑15分钟，其间每隔2‑3分钟颠倒混匀5‑10次得到含蛋白酶K的混合液；（9）将快速沉淀缓冲液加入到步骤（8）所述含蛋白酶K的混合液中，盖上离心管的盖子，颠倒10‑15次，得到悬浊液；（10）将步骤（9）得到的悬浊液进行常温离心分离，得到上清液；（11）分别将吸附柱置于收集管中，分别将步骤（10）所得上清液加入吸附柱中，常温离心分离，倒弃收集管中的滤液，将吸附柱套回收集管中；（12）将漂洗液1于吸附柱中，常温静置，常温离心分离，倒弃滤液，把吸附柱套回收集管中；（13）将漂洗液2于吸附柱中，常温离心分离，倒弃滤液，把吸附柱套回收集管中；（14）重复步骤（13）；（15）常温离心步骤（14）所得的吸附柱；（16）将离心后的吸附柱套在已灭菌的离心管中，将洗脱缓冲液或者灭菌水加入吸附柱的膜中央，静置后常温离心处理，弃去吸附柱，在离心管中得到一次洗脱液，一次洗脱液中含有所述目的质粒；（17）将步骤（16）所述洗脱液转移至步骤（15）的另一个吸附柱中进行洗脱，静置后常温离心处理，弃去吸附柱，在离心管中得到二次洗脱液，二次洗脱液中含有浓度增大的目的质粒；（18）以此类推直至所有吸附柱洗脱完全，得到最终洗脱液，即富集目的质粒DNA的洗脱液；（19）将步骤（18）中所述富集目的质粒DNA的洗脱液放在冰箱中冷藏保存。...

【技术特征摘要】
1.一种提取金黄色葡萄球菌质粒的方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）将含目的质粒的金黄色葡萄球菌接种于脑心浸出液/抗生素培养基中，摇床培养，扩增菌液，得到初级菌液；（2）接种步骤（1）所述的初级菌液至脑心浸出液/抗生素培养基中，摇床培养，扩增菌液，得到次级菌液；（3）将步骤（2）所述的次级菌液进行常温离心分离；离心后倒弃上层培养液，把离心管反扣于吸水纸上吸尽残液，得到装有金黄色葡萄球菌沉淀的离心管；（4）将溶菌酶和溶葡萄球菌酶加入到裂解细菌菌体的试剂中；得到裂解金黄色葡萄球菌的混合液；（5）将步骤（4）所述裂解金黄色葡萄球菌的混合液加入到步骤（3）所述装有金黄色葡萄球菌沉淀的离心管中，涡旋重悬处理至菌体全部重悬、离心管中无沉淀为止，然后恒温浴处理，得到重悬液；（6）将步骤（5）所述的重悬液转移至另一个离心管中，加入玻璃粉，涡旋混匀得到含玻璃粉的重悬液；（7）将碱裂解液加入步骤（6）所述含玻璃粉的重悬液中，盖上离心管盖子，颠倒离心管5-10次，得到混合液；（8）将蛋白酶K加入到步骤（7）所述混合液中，盖上离心管盖子，颠倒离心管5-10次，然后室温静置10-15分钟，其间每隔2-3分钟颠倒混匀5-10次得到含蛋白酶K的混合液；（9）将快速沉淀缓冲液加入到步骤（8）所述含蛋白酶K的混合液中，盖上离心管的盖子，颠倒10-15次，得到悬浊液；（10）将步骤（9）得到的悬浊液进行常温离心分离，得到上清液；（11）分别将吸附柱置于收集管中，分别将步骤（10）所得上清液加入吸附柱中，常温离心分离，倒弃收集管中的滤液，将吸附柱套回收集管中；（12）将漂洗液1于吸附柱中，常温静置，常温离心分离，倒弃滤液，把吸附柱套回收集管中；（13）将漂洗液2于吸附柱中，常温离心分离，倒弃滤液，把吸附柱套回收集管中；（14）重复步骤（13）；（15）常温离心步骤（14）所得的吸附柱；（16）将离心后的吸附柱套在已灭菌的离心管中，将洗脱缓冲液或者灭菌水加入吸附柱的膜中央，静置后常温离心处理，弃去吸附柱，在离心管中得到一次洗脱液，一次洗脱液中含有所述目的质粒；（17）将步骤（16）所述洗脱液转移至步骤（15）的另一个吸附柱中进行洗脱，静置后常温离心处理，弃去吸附柱，在离心管中得到二次洗脱液，二次洗脱液中含有浓度增大的目的质粒；（18）以此类推直至所有吸附柱洗脱完全，得到最终洗脱液，即富集目的质粒DNA的洗脱液；（19）将步骤（18）中所述富集目的质粒DNA的洗脱液放在冰箱中冷藏保存。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）中所述目的质粒含有抗-抗生素的基因；步骤（1）中所述摇床培养的温度为37℃，摇床培养的时间为10-12小时；步骤（2）中所述初级菌液的用量为1-3mL，即接种量为1-3mL；步骤（2）中所述脑心浸出液/抗生素培养基的用量为100-150mL；步骤（2）中所述摇床培养的温度为37℃，培养时间为12-...

【专利技术属性】
技术研发人员：闫鹤，万锈琳，
申请(专利权)人：华南理工大学，
类型：发明
国别省市：广东,44