基于电化学的辅酶还原型谷胱甘肽再生方法及酶电极技术

本发明专利技术公开了一种酶电极，为按照如下步骤制备而得：利用DCM降解菌MethylobacteriumH13制备获得重组工程菌，经诱导培养表达和纯化，得DCM脱卤酶纯酶液；将DCM脱卤酶纯酶液与海藻酸钠进行混合，得包埋料；将包埋料涂抹于电极基体表面，然后经Ca(NO3)2固定等，得酶电极。本发明专利技术还同时提供了利用上述酶电极进行的基于电化学的辅酶还原型谷胱甘肽GSH再生方法，包括在阴极电解槽注入含DCM废水、作为辅酶的还原型谷胱甘肽GSH，进行恒定电流电解。本发明专利技术利用电化学技术，以酶电极为媒介，为辅酶GSH再生提供充足的电子，促进GSSG再生成GSH。

Coenzyme-reduced glutathione regeneration method and enzyme electrode based on Electrochemistry

The invention discloses an enzyme electrode, which is prepared according to the following steps: using DCM degrading bacteria Methylobacterium H13 to prepare recombinant engineering bacteria, after induction, culture, expression and purification, the pure enzyme solution of DCM dehalogenase is obtained; the pure enzyme solution of DCM dehalogenase is mixed with sodium alginate to obtain the embedding material; the embedding material is coated on the surface of the electrode substrate, and then fixed by Ca (NO3) 2 to obtain the enzyme electricity. Extremely. The invention also provides an electrochemical method for regeneration of reduced glutathione GSH based on the above enzyme electrode, including constant current electrolysis by injecting DCM wastewater into the cathode electrolysis cell and using reduced glutathione GSH as the coenzyme. The invention utilizes electrochemical technology and takes enzyme electrode as medium to provide sufficient electrons for the regeneration of coenzyme GSH and promote the regeneration of GSSG into GSH.

【技术实现步骤摘要】
基于电化学的辅酶还原型谷胱甘肽再生方法及酶电极
本专利技术涉及一种基于电化学的辅酶还原型谷胱甘肽再生方法及酶电极。
技术介绍
谷胱甘肽广泛存在于动植物和微生物中，是细胞内最丰富的小分子硫醇类化合物。还原型谷胱甘肽(GSH)是细胞内非蛋白硫氢基团的主要组成部分，由谷氨酸(Glu)、半肌氨酸(Cys)和甘氨酸(Gly)经肽键缩合而成的三肽，相对分子质量为307.32，等电点为5.93，常温下为白色晶体，易溶于水、低浓度乙醇水溶液、液氨和二甲基甲酰胺，在生物体内大量存在并起主要作用。目前已有的再生方法包括酶法、电化学法再生辅酶、光化学法等。酶法再生的优点在于反应速率快，选择性高，再生体系与合成体系兼容性好；但所用酶往往比较昂贵，且体系涉及两种或两种以上酶；另，酶的最适应用条件往往不一致，给过程优化带来困难。光化学法利用的是廉价且洁净的光能，通常需要光敏剂、电子媒介物和电子供体。光化学再生法目前还没有得到理想的效果，其再生效率很低，但具有广阔的潜在应用价值。电化学法的再生能量来自于洁净的电能，与酶法相比成本低。电化学法中氧化还原电势的控制和反应过程的监测都较为容易，具有操作简单、灵敏度高、仪器设备简单等优点。目前，现有的电化学辅酶再生法具体为：在负载有谷胱甘肽还原酶(GR)的电极上施加一个负电位，E＝-0.72V(相对于参比电极)，将氧化型谷胱甘肽GSSG还原成还原型谷胱甘肽GSH，其机理可以总结为以下公式：其中，NADPH起传递电子的作用，将电极上的电子转移到酶上，完成GSH的再生过程。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种基于电化学的辅酶还原型谷胱甘肽(GSH)再生方法及所用酶电极，本专利技术的方法过程简单，再生成本较低。为了解决上述技术问题，本专利技术提供一种酶电极，按照如下步骤制备而得：1)、利用DCM降解菌MethylobacteriumH13(CCTCCNo：M2010121)制备获得重组工程菌；将重组工程菌进行诱导培养表达和纯化，从而获得浓度为1.366±0.2g/L的DCM脱卤酶纯酶液；2)制备酶电极(作为媒介)：先将导电材料依次进行抛光处理、洗净、晾干，得电极基体；按照8～12ml/1g的液料比，将DCM脱卤酶纯酶液与海藻酸钠进行混合，得包埋料；将包埋料涂抹于电极基体表面，并确保整个电极基体表面全部被包埋料所包裹；然后于室温下置于浓度为10±1g/L的Ca(NO3)2溶液中固定10±2min；再用超纯水进行水洗(从而洗去附着于酶电极表面的Ca(NO3)2溶液)，得酶电极(即，固载酶的电极)。作为本专利技术的酶电极的改进：所述步骤2)中，将包埋料涂抹于电极基体表面，形成半球体；并确保整个电极基体表面全部被半球体包裹于内部。当电极基体的直径为1.5cm时，半球体的半径约为2cm。作为本专利技术的酶电极的进一步改进：从DCM降解菌MethylobacteriumH13(CCTCCNo：M2010121)的全基因组中克隆得到DCM脱卤酶基因，将其连接至pET28b(+)质粒，导入大肠杆菌E.coliBL21(DE3)，从而得到重组工程菌。作为本专利技术的酶电极的进一步改进：所述导电材料为石墨或玻碳。本专利技术还同时提供了利用上述酶电极进行的基于电化学的辅酶还原型谷胱甘肽(GSH)再生方法(电化学辅酶再生方法)：以酶电极作为阴极，铂电极作为阳极，使用阳离子交换膜将反应器分隔为阳极电解槽(阳极室)和阴极电解槽(阴极室)，在阴极电解槽注入含DCM废水、作为辅酶的还原型谷胱甘肽GSH，阴极电解槽内，GSH与含DCM废水的料液比为5～35mg/L；调节pH为7～8，调节水浴温度为25～45℃，用电源控制电路电流为5～45mA进行恒定电流电解2±0.5h。作为本专利技术的基于电化学的辅酶还原型谷胱甘肽再生方法的改进：调节pH为7.0，调节水浴温度为35℃，用电源控制电路电流15mA；电解时间为2h。本专利技术体现了生物电化学脱氯过程中发生还原型谷胱甘肽再生；GSSG在阴极提供电子还原力的驱动下被再生为GSH。传统二氯甲烷(DCM)降解方法首先在还原型谷胱甘肽(GSH)和DCM脱卤酶的作用下，脱去一个Cl原子，形成S-氯甲基谷胱甘肽，然后通过自身水解反应再脱去一个Cl原子，进一步被水解为氧化型谷胱甘肽(GSSG)和甲醛；甲醛继续被氧化为CO2和H2O。微生物细胞内还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)是氧化型谷胱甘肽(GSSG)再生为还原型谷胱甘肽(GSH)的氢供体。当细胞内缺乏足量电子供体时，NADP+无法及时转化为NADPH，从而制约了还原型谷胱甘肽再生过程；本专利技术提出应用电化学技术来强化上述过程，通过电化学方法为辅酶再生提供充足的电子，促进氧化型谷胱甘肽(GSSG)再生成还原型谷胱甘肽(GSH)。本专利技术的优点在于GSSG在阴极提供电子还原力的驱动下被再生为GSH。利用电化学技术，以酶电极为媒介，为辅酶GSH再生提供充足的电子，促进GSSG再生成GSH。附图说明下面结合附图对本专利技术的具体实施方式作进一步详细说明。图1是本专利技术的装置图；图2为本专利技术中DCM降解率随时间的变化关系图；图3为不同条件下的辅酶的再生图；图4为GSH再生的最适电流图；图5为GSH再生的最适pH图；图6为GSH再生的最适温度图；图7为DCM浓度对GSH再生的影响图；图8为不同酶固定方法DCM降解率随时间变化关系图。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术进行进一步描述，但本专利技术的保护范围并不仅限于此：实施例1、用于处理含DCM废水的酶电极的制备方法，依次以下步骤：1)、以石墨作为导电材料，将石墨依次用直径为1.0、0.3、0.05和0.01μm氧化铝粉在麂皮上抛光(打磨光滑即可)，然后置于超纯水中超声清洗5min，得到表面干净的石墨基体(直径约1.5cm)；取出自然晾干至表面无可见水分，得电极基体。2)、利用重组工程菌制备DCM脱卤酶纯酶液：①先利用DCM降解菌MethylobacteriumH13(CCTCCNo：M2010121)制备获得重组工程菌，具体如下：从DCM降解菌MethylobacteriumH13(CCTCCNo：M2010121)的全基因组中经PCR克隆得到DCM脱卤酶基因。为了克隆，上下游引物分别加上限制性酶切位点BamHI和XhoI，酶切位点前面分别加了保护碱基，具体如下：PrimerS1(5’-TCCGGATCCATGGTGAGCCCGAATCCAACGAAC-3’)BamHIPrimerS2(5’-ATAATTCTCGAGAGCGACTGCCGCGCCCTC-3’)XhoI构建50μL的PCR扩增体系：4μLdNTP、5μL10×buffer、1μL引物P2、1μL引物P5、1.75μLDNA、无菌去离子水补足至50μL。PCR反应条件设定为：PCR产物即为DCM脱卤酶基因，DCM脱卤酶基因的序列如序列表NO1所述。将其连接至pET28b(+)质粒，导入大肠杆菌E.coliBL21(DE3)，从而得到重组工程菌。连接反应体系如下：转化方法如下：在100mL融化状态的LB培养基中加入500μL(10mg/mL)Kan，还未凝固时混合均匀倒入灭菌培养皿中。取出1管大肠杆菌E.coliBL21(DE3)感受态细胞，放置于冰里融化本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.酶电极，其特征是按照如下步骤制备而得：1)、利用DCM降解菌MethylobacteriumH13制备获得重组工程菌；将重组工程菌进行诱导培养表达和纯化，从而获得浓度为1.366±0.2g/L的DCM脱卤酶纯酶液；2)制备酶电极：先将导电材料依次进行抛光处理、洗净、晾干，得电极基体；按照8～12ml/1g的液料比，将DCM脱卤酶纯酶液与海藻酸钠进行混合，得包埋料；将包埋料涂抹于电极基体表面，并确保整个电极基体表面全部被包埋料所包裹；然后于室温下置于浓度为10±1g/L的Ca(NO3)2溶液中固定10±2min；再用超纯水进行水洗，得酶电极。

【技术特征摘要】
1.酶电极，其特征是按照如下步骤制备而得：1)、利用DCM降解菌MethylobacteriumH13制备获得重组工程菌；将重组工程菌进行诱导培养表达和纯化，从而获得浓度为1.366±0.2g/L的DCM脱卤酶纯酶液；2)制备酶电极：先将导电材料依次进行抛光处理、洗净、晾干，得电极基体；按照8～12ml/1g的液料比，将DCM脱卤酶纯酶液与海藻酸钠进行混合，得包埋料；将包埋料涂抹于电极基体表面，并确保整个电极基体表面全部被包埋料所包裹；然后于室温下置于浓度为10±1g/L的Ca(NO3)2溶液中固定10±2min；再用超纯水进行水洗，得酶电极。2.根据权利要求1所述的酶电极，其特征是：所述步骤2)中，将包埋料涂抹于电极基体表面，形成半球体；并确保整个电极基体表面全部被半球体包裹于内部。3.根据权利要求1或2所述的酶电极，其特征是：从DCM降解菌Methylobacteriu...

【专利技术属性】
技术研发人员：於建明，汤育炜，吴朦，王佳哲，宋永泉，胡俊，成卓韦，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33