一种类芽孢杆菌甲壳素酶及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种类芽孢杆菌甲壳素酶及其制备方法和应用。本发明专利技术类芽孢杆菌甲壳素酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，编码该类芽孢杆菌甲壳素酶的基因的核酸序列如SEQ ID NO.1所示。利用大肠杆菌表达系统，可高效可溶性表达该类芽孢杆菌甲壳素酶。然后利用离子液体对蟹壳粉进行预处理，以纯化后的类芽孢杆菌甲壳素酶为催化剂，同未处理的蟹壳粉相比，处理后的蟹壳粉的酶解效率提高了三倍。因此，本发明专利技术类芽孢杆菌甲壳素酶及其在酶解离子液体预处理后蟹壳粉中的应用，具有良好的工业应用前景。

A Bacillus-like Chitinase and Its Preparation and Application

The invention discloses a bacillus-like chitinase, a preparation method and application thereof. The amino acid sequence of the bacillus-like chitinase is shown in SEQ ID NO.2 and the nucleic acid sequence of the gene encoding the bacillus-like chitinase is shown in SEQ ID NO.1. Using the expression system of E. coli, the chitinase of Bacillus spp. can be expressed efficiently and solubly. Then, the crab shell powder was pretreated with ionic liquids, using purified Bacillus chitinase as catalyst. Compared with untreated crab shell powder, the enzymatic hydrolysis efficiency of the treated crab shell powder increased three times. Therefore, the bacillus-like chitinase of the invention and its application in the pretreatment of crab shell powder by enzymatic hydrolysis of ionic liquids have good industrial application prospects.

【技术实现步骤摘要】
一种类芽孢杆菌甲壳素酶及其制备方法和应用
本专利技术属于生物
，具体涉及一种类芽孢杆菌甲壳素酶及其制备方法和应用。
技术介绍
甲壳素酶（Chitinase,EC.3.2.1.12）是一类可水解甲壳素中β-1,4糖苷键的水解酶，主要存在于细菌、真菌及植物中。根据其结构特征，可分为糖苷水解酶（Glycosidehydrolase,GH）18和19两个家族，大部分细菌来源的甲壳素酶属于GH18家族，而GH19家族甲壳素酶主要为植物来源。甲壳寡糖是甲壳素经甲壳素酶水解得到的低聚糖，在医药、食品保健和植物防御等方面的应用已经被发掘，并已成为甲壳素研究的一个热点。在工业上，常用化学法（强酸、强碱）和物理法对甲壳素类生物大分子进行水解以制备甲壳低聚糖，但这两种方法制备的壳寡糖产品性质不稳定、降解条件难以控制，且化学法对环境污染较严重。酶法转化甲壳素为下游壳聚糖及壳寡糖类产品，是降低传统化学法对环境造成污染的一个有效的解决途径。蛋白酶及纤维素酶等非特异性酶的使用，虽然能在一定程度上缓解以上状况，但专一性的不足限制了此类酶制剂的使用。因此，研发高活性的甲壳素酶对壳寡糖类产品的工业生产具有重要意义。本专利技术研究人员前期从含甲壳素土壤中筛选出一株产甲壳素酶菌株，通过对其发酵培养基进行优化，使其甲壳素酶产量有了一定的提高。通过对其全基因组进行测序及分析，发现该菌株有多种甲壳素酶基因。因此，为获得高活性的甲壳素酶，我们选择选取其中一种甲壳素基因进行克隆并在大肠杆菌中进行表达。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种类芽孢杆菌甲壳素酶及其制备方法和应用，旨在提供一种经济高效的甲壳素酶，并将其应用于经离子液体预处理的蟹壳粉末的降解中，具有很好的工业化应前景。本专利技术为实现上述目的所采用的技术方案如下。一种类芽孢杆菌甲壳素酶，所述类芽孢杆菌甲壳素酶的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。优选的，编码该类芽孢杆菌甲壳素酶的基因的核酸序列如SEQIDNO.1所示。以上所述的一种类芽孢杆菌甲壳素酶的制备方法，该方法包括以下步骤：将核酸序列如SEQIDNO.1所示的甲壳素酶基因与表达载体连接，构建重组载体，然后将重组载体转入表达菌株中，诱导并获得可胞内可溶性表达的类芽孢杆菌甲壳素酶。优选的，所述甲壳素酶基因(PpChi1)来源于类芽孢杆菌菌株CS0611(分类命名为PaenibacilluspasadenensisCS0611，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCCNO：M2014458，保藏日期为2014年10月8日)，为本实验室筛选得到，其全基因组测序由深圳华大基因完成。通过IlluminaHiseq2500平台测序，样品共产出1,255Mb数据。基因组组分分析后发现，样品paenibacillus的基因组含有5,468个基因，总长度为4,848,621bp，平均长度887bp，占基因组全长的85.63％。串联重复序列共964个，总长为73,335bp，占基因组全长的1.2952％。小卫星序列701个，微卫星序列52个，tRNA22个，rRNA0个。优选的，所述表达载体为pET-22b、pET-28a及pET-30a中的一种。优选的，所述表达菌株为大肠杆菌BL21(DE3)。优选的，所述诱导是在添加了0.1-1.0mMIPTG的LB液体培养基中，温度为16-30℃下诱导16-24h。优选的，所述类芽孢杆菌甲壳素酶制备的具体步骤包括：（1）将甲壳素酶PpChi1氨基酸序列SEQIDNO.2提交至生物信息学数据库SignalP4.1Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)，对其进行信号肽分析；（2）利用PCR扩增出无信号肽的甲壳素酶目的基因，并将目的基因与表达载体pET-28a连接，构建重组质粒并对其进行测序以验证序列正确性；（3）将上述重组质粒转化至表达菌株大肠杆菌E.coliBL21(DE3),经IPTG诱导培养获得甲壳素酶；（4）对胞内表达甲壳素酶PpChi1的大肠杆菌进行破碎，取上清经亲和层析柱纯化，获得可溶性表达的PpChi1；（5）对上述纯化后的甲壳素酶进行活力测定，并用SDS-PAGE对其纯度进行分析。以上所述的一种类芽孢杆菌甲壳素酶的应用，包括以下步骤：利用离子液体对蟹壳粉进行预处理，然后以预处理后的蟹壳粉为底物，纯化的类芽孢杆菌甲壳素酶为催化剂，酶解制备具有还原性的可溶性甲壳寡糖。优选的，所述离子液体为1-烯丙基-3-乙基咪唑氯盐、1-丁基-3-甲基咪唑四氟氯盐、1-丁基-3-甲基咪唑醋酸盐和1-乙基-3-甲基咪唑醋酸盐中的一种以上。优选的，所述预处理条件为：固液比为1-4wt%，预处理温度为80-140℃，时间为0.5-3h。优选的，所述酶解的体系为：0.1-0.2mg类芽孢杆菌甲壳素酶，10-30mg预处理的蟹壳粉，酶解时间为1-24h。优选的，所述构建甲壳寡糖制备体系的具体步骤包括：（1）将一定量的蟹壳粉末与离子液体混合，在特定的温度和时间下进行预处理；（2）上述预处理的蟹壳粉-离子液体胶状物，经加水沉淀甲壳素，然后对沉淀物进行抽滤分离离子液体溶液；（3）上述沉淀物经冻干即为预处理后的甲壳素酶底物，回收的离子液体溶液经减压旋蒸浓缩后可再次用于预处理的溶剂；（4）以上述预处理的蟹壳粉为底物，纯化的甲壳素酶为催化剂，在适宜的温度和缓冲液条件下进行水解反应，以DNS法检测水解混合物中的寡糖含量。与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：（1）本专利技术的甲壳素酶来源于类芽孢杆菌PaenibacilluspasadenensisCS0611，使用大肠杆菌BL21(DE3)为表达菌株。此前未有Paenibacilluspasadenensis来源的甲壳素酶被报道，且所用质粒pET-28a为高表达载体，大肠杆菌BL21(DE3)为工业化生产生物催化酶制剂常用菌株。因此，本专利技术所述甲壳素酶不仅有一定的学术价值，而且可大量生产，作为农业级甲壳寡糖的工业化生产用酶制剂。（2）本专利技术所用的蟹壳粉底物为离子液体预处理后的底物，结晶度大大降低，水解效率大大提高。未经处理的蟹壳粉为甲壳素、蛋白质和碳酸钙的混合物，结晶度较高，不易水解，经离子液体预处理后，水解效率提高了3倍。用离子液体直接对蟹壳粉进行预处理，未经过传统的强酸强碱操作过程，降低对环境的影响，且离子液体可回收再利用。因此，本专利技术所述的甲壳寡糖制备体系具有巨大的应用潜力，对虾蟹壳的高值化应用具有重要意义。附图说明图1是本专利技术所述甲壳素酶PpChi1纯化后的SDS-PAGE结果图。图2是甲壳素酶PpChi1在不同温度下的活力对比图，最适温度处的活力定义为100%。图3是甲壳素酶PpChi1在不同pH下的活力对比图，最适pH处的活力定义为100%。图4a、图4b分别是蟹壳粉末预处理前后的SEM图。图5是使用甲壳素酶PpChi1水解预处理后蟹壳粉的时间曲线图，图中横坐标为时间，纵坐标为反应产生的还原糖浓度。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术的技术方案做进一步详细的描述，但本专利技术的实施方式不限于此。实施例1类芽孢杆菌甲壳素酶PpChi1的克隆表达和酶学性质表征（1）PpChi1的克隆表达与分离本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种类芽孢杆菌甲壳素酶，其特征在于，所述类芽孢杆菌甲壳素酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2 所示。

【技术特征摘要】
1.一种类芽孢杆菌甲壳素酶，其特征在于，所述类芽孢杆菌甲壳素酶的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。2.根据权利要求1所述的一种类芽孢杆菌甲壳素酶，其特征在于，编码该类芽孢杆菌甲壳素酶的基因的核酸序列如SEQIDNO.1所示。3.制备权利要求1所述的一种类芽孢杆菌甲壳素酶的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：将核酸序列如SEQIDNO.1所示的甲壳素酶基因与表达载体连接，构建重组载体，然后将重组载体转入表达菌株中，诱导并获得可胞内可溶性表达的类芽孢杆菌甲壳素酶。4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述表达载体为pET-22b、pET-28a及pET-30a中的一种。5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述表达菌株为大肠杆菌BL21(DE3)。6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述诱导是在添加了0.1-1.0mMIPT...

【专利技术属性】
技术研发人员：娄文勇，徐培，宗敏华，程建华，杨继国，
申请(专利权)人：华南理工大学，
类型：发明
国别省市：广东,44