本发明专利技术公开了一种类芽孢杆菌甲壳素酶及其应用。该类芽孢杆菌甲壳素酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示,编码该类芽孢杆菌甲壳素酶的基因的核酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明专利技术利用大肠杆菌表达系统,可高效可溶性表达该甲壳素酶。然后,利用以该酶和另一种甲壳素酶的混合酶溶液为催化剂,协同水解离子液体预处理后的蟹壳粉,和单一酶催化过程相比,双酶协同催化的酶解效率提高了1.3‑3.5倍。因此,该甲壳素酶及其协同另外一种甲壳素酶在蟹壳粉酶解过程中的应用,具有良好的工业应用前景。
A Bacillus-like Chitinase and Its Application
The invention discloses a bacillus-like chitinase and its application. The amino acid sequence of the Bacillus chitinase is shown in SEQ ID NO.1 and the nucleic acid sequence of the gene encoding the Bacillus chitinase is shown in SEQ ID NO.2. The invention utilizes the expression system of E. coli to express the chitinase efficiently and solubly. Then, using the mixed enzyme solution of this enzyme and another chitinase as catalyst, the synergistic hydrolysis of crab shell powder pretreated with ionic liquids can increase the enzymatic hydrolysis efficiency by 1.3 to 3.5 times compared with the single enzyme catalytic process. Therefore, the chitinase and its synergistic application in the enzymatic hydrolysis of crab shell powder have good industrial application prospects.
【技术实现步骤摘要】
一种类芽孢杆菌甲壳素酶及其应用
本专利技术属于生物
,具体涉及一种类芽孢杆菌甲壳素酶及其应用。
技术介绍
甲壳素酶(Chitinase,EC.3.2.1.12)是一类可水解甲壳素中β-1,4糖苷键的水解酶,主要存在于细菌、真菌及植物中。根据其结构特征,可分为糖苷水解酶(Glycosidehydrolase,GH)18和19两个家族,大部分细菌来源的甲壳素酶属于GH18家族,而GH19家族甲壳素酶主要为植物来源。甲壳寡糖是甲壳素经甲壳素酶水解得到的低聚糖,在医药、食品保健和植物防御等方面的应用已经被发掘,并已成为甲壳素研究的一个热点。在工业上,常用化学法(强酸、强碱)和物理法对甲壳素类生物大分子进行水解以制备甲壳低聚糖,但这两种方法制备的壳寡糖产品性质不稳定、降解条件难以控制,且化学法对环境污染较严重。酶法转化甲壳素为下游壳聚糖及壳寡糖类产品,是降低传统化学法对环境造成污染的一个有效的解决途径。蛋白酶及纤维素酶等非特异性酶的使用,虽然能在一定程度上缓解以上状况,但专一性的不足限制了此类酶制剂的使用。因此,研发高活性的甲壳素酶对壳寡糖类产品的工业生产具有重要意义。自然界中,多菌种混合发酵在纤维素类生物质的水解中发挥重要作用,而在此过程中,产生多种生物酶可实现对纤维素的高效利用。多酶协同催化可弥补单一酶制剂催化过程中的不足,同时可能存在的互相促进作用可进一步实现底物水解效率的最大化。本专利技术研究人员前期从本课题组筛选的一株产甲壳素酶菌株中克隆得到一个甲壳素酶PpChi1,在前期工作基础上,本专利技术从该菌株中克隆的到另一个甲壳素酶,实现其可溶性表达,对其进行表征,并考察了两种甲壳素酶协同水解甲壳素制备甲壳寡糖的过程。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种类芽孢杆菌甲壳素酶及其应用,旨在提供一种高效降解甲壳素制备壳寡糖的方法,克服目前现有技术的不足。本专利技术为实现上述目的所采用的技术方案如下。一种类芽孢杆菌甲壳素酶,所述类芽孢杆菌甲壳素酶的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。优选的,编码该类芽孢杆菌甲壳素酶的基因的核酸序列如SEQIDNO.2所示。优选的,制备该类芽孢杆菌甲壳素酶的方法包括以下步骤:将SEQIDNO.2所示的类芽孢杆菌甲壳素酶基因(PpChi2)与表达载体连接,构建重组载体,然后将重组载体转入表达菌株中,诱导并获得可胞内可溶性表达的类芽孢杆菌甲壳素酶。优选的,所述类芽孢杆菌甲壳素酶基因来源于类芽孢杆菌菌株CS0611(分类命名为PaenibacilluspasadenensisCS0611,保藏单位为中国典型培养物保藏中心,保藏地址为中国.武汉.武汉大学,保藏编号为CCTCCNO:M2014458,保藏日期为2014年10月8日),为本实验室筛选得到,其全基因组测序由深圳华大基因完成。进一步优选的,所述表达载体为pET-22b,pET-28a及pET-30a中的一种。进一步优选的,所述表达菌株为大肠杆菌BL21(DE3)。进一步优选的,所述诱导是在添加了0.1-1.0mMIPTG的LB液体培养基中,温度为16-30℃下诱导16-24h。进一步优选的,所述类芽孢杆菌甲壳素酶制备的具体步骤包括:(1)将甲壳素酶PpChi2氨基酸序列SEQIDNO.1提交至生物信息学数据库SignalP4.1Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/),对其进行信号肽分析;(2)利用PCR扩增出无信号肽的甲壳素酶目的基因,并将目的基因与表达载体pET-28a连接,构建重组质粒并对其进行测序以验证序列正确性;(3)将上述重组质粒转化至表达菌株大肠杆菌E.coliBL21(DE3),经IPTG诱导培养获得甲壳素酶;(4)对胞内表达甲壳素酶PpChi2的大肠杆菌进行破碎,取上清经亲和层析柱纯化,获得可溶性表达的PpChi2;(5)对上述纯化后的甲壳素酶进行活力测定,并用SDS-PAGE对其纯度进行分析。以上所述的一种类芽孢杆菌甲壳素酶的应用,包括以下步骤:以两种甲壳素酶混合成的酶液为催化剂,以预处理后的蟹壳粉为底物,双酶协同水解蟹壳粉制备可溶性的甲壳寡糖;其中,两种甲壳素酶包括类芽孢杆菌甲壳素酶PpChi1和类芽孢杆菌甲壳素酶PpChi2,所述类芽孢杆菌甲壳素酶PpChi1的氨基酸序列如SEQIDNO.3所示,所述类芽孢杆菌甲壳素酶PpChi2的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。优选的,所述类芽孢杆菌甲壳素酶PpChi1和类芽孢杆菌甲壳素酶PpChi2的体积比为1:4-4:1。优选的,所述甲壳素酶总用量为0.1-0.2mg,预处理后的蟹壳粉的用量为10-30mg。优选的,所述酶解的时间为1-24h,酶解的温度为30-50℃。与现有技术相比,本专利技术具有如下有益效果:(1)本专利技术的甲壳素酶来源于类芽孢杆菌PaenibacilluspasadenensisCS0611,使用大肠杆菌BL21(DE3)为表达菌株。此前未有Paenibacilluspasadenensis来源的甲壳素酶被报道,且所用质粒pET-28a为高表达载体,大肠杆菌BL21(DE3)为工业化生产生物催化酶制剂常用菌株。因此,本专利技术所述甲壳素酶不仅有一定的学术价值,而且可大量生产,作为农业级甲壳寡糖的工业化生产用酶制剂。(2)本专利技术所用的蟹壳粉底物为离子液体预处理后的底物,结晶度大大降低,水解效率大大提高。两种甲壳素酶协同降解甲壳素,其催化效率同单一酶催化相比,均有提高。因此,本专利技术所述的双酶协同降解甲壳素制备甲壳寡糖的体系具有巨大的应用潜力,对虾蟹壳的高值化应用具有重要意义。附图说明图1是本专利技术所述甲壳素酶PpChi2纯化后的SDS-PAGE电泳图。图2是温度对甲壳素酶PpCh2相对酶活影响曲线图,最适温度处的活力定义为100%。图3是pH对甲壳素酶PpChi2相对酶活影响曲线图,最适pH处的活力定义为100%。图4是不同比例PpChi1和PpChi2对其协同水解预处理后蟹壳粉的影响图。图5是特定比例PpChi1和PpChi2协同水解预处理后蟹壳粉的时间曲线图。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术的技术方案做进一步详细的描述,但本专利技术的实施方式不限于此。实施例1类芽孢杆菌甲壳素酶PpChi2的克隆表达与分离纯化(1)PpChi2的克隆根据基因组测序结果,选取含有信号肽序列的PpChi2的基因序列(GenebankNo.:KX431049.1)为研究对象,结合信号肽序列预测结果,设计正向引物Chip1_F:5’-GGAATTCCATATGGCGGCCTGGACGCCCGGC-3’,反向引物Chip1_R:5’-GACCGCTCGAGGCCGAAGTAGCCCTTCATCGCGT-3’,以PaenibacilluspasadenensisCS0611的基因组为模板,扩增PpChi2。PCR反应体系为:10μL5XQ5reactionbuffer,1μL10mMdNTPs,2.5μL10μMChip2_F和Chip2_R,1μL基因组DNA,0.5μLQ5高保真DNA聚合酶,10μL5XQ5highGCenhancer,23μLddH2O。PCR反应条件为:98℃预变性30s,98℃变性10s,72℃退火10s本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种类芽孢杆菌甲壳素酶,其特征在于,所述类芽孢杆菌甲壳素酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1 所示。
【技术特征摘要】
1.一种类芽孢杆菌甲壳素酶,其特征在于,所述类芽孢杆菌甲壳素酶的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。2.根据权利要求1所述的一种类芽孢杆菌甲壳素酶,其特征在于,编码该类芽孢杆菌甲壳素酶的基因的核酸序列如SEQIDNO.2所示。3.根据权利要求1所述的一种类芽孢杆菌甲壳素酶,其特征在于,制备该类芽孢杆菌甲壳素酶的方法包括以下步骤:将SEQIDNO.2所示的类芽孢杆菌甲壳素酶基因与表达载体连接,构建重组载体,然后将重组载体转入表达菌株中,诱导并获得可胞内可溶性表达的类芽孢杆菌甲壳素酶。4.根据权利要求1所述的一种类芽孢杆菌甲壳素酶,其特征在于,所述表达载体为pET-22b,pET-28a及pET-30a中的一种。5.根据权利要求1所述的一种类芽孢杆菌甲壳素酶,其特征在于,所述表达菌株为大肠杆菌BL21(DE3)。6.根据权利要求1所述的一种类芽孢杆菌甲壳素酶,其特征在于,所述诱导是在添加了0.1-1.0mMIPT...
【专利技术属性】
技术研发人员:娄文勇,徐培,宗敏华,程建华,杨继国,
申请(专利权)人:华南理工大学,
类型:发明
国别省市:广东,44
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