本发明专利技术公开了一种L‑苯丙氨酸转氨酶多肽，其可以以高水平从核酸表达，具有高酶促活性；编码该多肽的核酸；生产该多肽的方法及该多肽在在生产苯丙酮酸中的应用。本发明专利技术中提供的苯丙酮酸合成方法，特异性的合成苯丙酮酸和标记的苯丙酮酸，经济性很高，同时无环境污染，无有毒化学试剂的使用，具有“绿色化学和绿色工业”的特征。
A L-phenylalanine aminotransferase polypeptide and its application
The invention discloses a L phenylalanine aminotransferase polypeptide, which can be expressed from nucleic acid at a high level and has high enzymatic activity; a nucleic acid encoding the polypeptide; a method for producing the polypeptide and the application of the polypeptide in the production of phenylpyruvate. The method for synthesizing phenylpyruvic acid provided in the invention has high economy, no environmental pollution, no use of toxic chemical reagents, and has the characteristics of \green chemistry and green industry\ for the specific synthesis of phenylpyruvic acid and labeled phenylpyruvic acid.
【技术实现步骤摘要】
一种L-苯丙氨酸转氨酶多肽及其应用
本专利技术属于蛋白质工程领域，具体涉及L-苯丙氨酸转氨酶多肽、编码该多肽的核酸、生产该多肽的方法及该多肽在在生产苯丙酮酸中的应用。
技术介绍
L-苯丙氨酸代谢途径是植物次生代谢最重要的途径之一，可代谢生成黄酮、花青素、芳香族香气等代谢物，苯丙酮酸可能是该途径的关键中间体物质，因此研究苯丙酮酸的代谢具有重要的意义。然而该途径在大部分植物中还是未知的，需要标记的苯丙酮酸来开展相应的科学研究。但是标记的苯丙酮酸确是商业上无法购买的。生物合成是继化学合成之后兴起的化合物合成方法。在化合物合成应用方面，生物合成具有成本低，能耗少，无环境污染，产物单一等特点，从而受到广泛的关注。现在苯丙酮酸需要通过化学或生物合成的方式获得。通过化学合成手段具有其不可避免的缺点。一方面，化学合成的方法容易造成环境污染。另一方面，通过化学合成的方法很难得到单一的产物，存在较多的副产物。因此提供一种环境友好的，同时专一性的合成标记苯丙酮酸的方法是非常有必要的。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供L-苯丙氨酸转氨酶多肽，其可以以高水平从核酸表达，具有高酶促活性；编码该多肽的核酸；生产该多肽的方法及该多肽在在生产苯丙酮酸中的应用。本专利技术提供了下面的(A)或(B)代表的多肽：(A)有SEQIDNO：2的氨基酸序列组成的多肽；或(B)由包括一个或几个氨基酸的缺失、替代或添加的SEQIDNO：2的氨基酸组成并且具有L-苯丙氨酸转氨酶活性的多肽。本专利技术提供了编码上述(A)或(B)代表的多肽的核酸。作为本专利技术的核酸，在下面的(a)或(b)中描述的核酸可以作为示例。(a)由SEQIDNO：1的核酸序列组成的DNA；或(b)DNA，其在严格条件下与由与DNA(a)互补的核苷酸序列组成的DNA杂交。SEQIDNO：1的核酸序列组成的核酸可以通过巢式PCR以茶叶cDNA为模板扩增得到。巢式PCR外侧引物的前引物为TTTGTTGCCATGCAGAGTGC(SEQIDNO：3)，后引物为TAGCCAGTATCGGCCTGAAT(SEQIDNO：4)；内侧引物的前引物为CCGGATATCATGGAAAATGGAGG(SEQIDNO：5)，后引物为GCCGGAGCTCTTAGTATTCTATTTGC(SEQIDNO：6)。PCR第一轮扩增程序为：98℃，10s；60℃，15s；72℃，1min，一共35个扩增循环。第二轮PCR扩增程序为：98℃，10s；45℃，15s；72℃，1min，一共2个扩增循环。98℃，10s；65℃，15s；72℃，1min，一共33个扩增循环。生产所述多肽的方法没有具体限制，只要可以得到该序列的多肽。例如通过肽合成技术，或者使用编码该多肽的核酸通过基因工程技术，可以生产该多肽。本专利技术提供了生产本专利技术的多肽的方法，其包括至少下面的步骤(1)和(2)。(1)从至少一种本专利技术的核酸表达多肽的步骤；和(2)收集步骤(1)中表达的多肽的步骤。本专利技术的生产方法可以还包括另一步骤。例如，可以在步骤(2)后进行纯化本专利技术的多肽的步骤。纯化方法，例如盐析、离心、透析、超滤、吸附层析、离子交换层析、疏水层析、反相层析、凝胶过滤、凝胶渗透层析、亲和层析、电泳及其组合。所述多肽具有L-苯丙氨酸转氨酶活性。本专利技术所述多肽可以以L-苯丙氨酸为底物，进行酶促反应，特异性的生成苯丙酮酸，当L-苯丙氨酸为稳定同位素标记的L-苯丙氨酸时，可以特异性的生成标记的苯丙酮酸。合成方法包括将含有L-苯丙氨酸转氨酶、L-苯丙氨酸、BIS-TRISpropane缓冲液的混合液恒温反应后加入盐酸进行酸化的步骤。进一步地，1mL的反应体系中含有10～50μgL-苯丙氨酸转氨酶、10mML-苯丙氨酸、50mMBIS-TRISpropane缓冲液，其中BIS-TRISpropane缓冲液pH8.5，含有1mM二硫苏糖醇，225μM磷酸吡哆醛，10％(w/v)D-山梨糖醇。进一步地，混合液于30～50℃恒温反应1.5～5h。进一步地，混合液恒温反应后加入200μL的1M盐酸进行酸化，继续在相应的温度下反应30min。本专利技术的有益效果是：本专利技术提供了一种L-苯丙氨酸转氨酶，使用该L-苯丙氨酸转氨酶，以L-苯丙氨酸为底物，通过L-苯丙氨酸转氨反应特异性生成苯丙酮酸，当底物为稳定同位素标记的L-苯丙氨酸时，可以特异性生成标记的苯丙酮酸。该方法是一种经济性很高的方法，同时无环境污染，无有毒化学试剂的使用，具有“绿色化学和绿色工业”的特征。利用本专利技术提供了编码L-苯丙氨酸转氨酶的基因，可以通过体外蛋白表达获得的重组蛋白。该基因还可以作为未来基因改造的骨架，通过氨基酸的替换，人工智能设计出催化效率较高的L-苯丙氨酸转氨酶。附图说明图1为纯化的CsAAAT1重组蛋白，A：SDS-PAGE胶图；B：Western-blot胶图。具体实施方式下面进一步列举实施例以详细说明本专利技术。同样应理解，以下实施例只用于对本专利技术进行进一步说明，不能理解为对本专利技术保护范围的限制，本领域技术人员根据本专利技术阐述的原理做出的一些非本质的改进和调整均属于本专利技术的保护范围。下述示例具体的工艺参数等也仅是合适范围中的一个示例，即本领域技术人员可以通过本文的说明做合适范围内的选择，而并非要限定于下文示例的具体数据。本专利技术从茶树中克隆得到一个L-苯丙氨酸转氨酶，在大肠杆菌进行异源表达后得到重组蛋白。利用得到的重组蛋白以L-苯丙氨酸为底物，进行酶促反应，特异性的生成苯丙酮酸，进一步地，以稳定同位素标记的L-苯丙氨酸为底物，进行酶促反应，特异性的生成标记的苯丙酮酸。实施例1L-苯丙氨酸转氨酶的制备茶树苯丙氨酸转氨酶CsAAAT1基因克隆采用巢式PCR，外侧引物的前引物为TTTGTTGCCATGCAGAGTGC(SEQIDNO：3)，后引物为TAGCCAGTATCGGCCTGAAT(SEQIDNO：4)；内侧引物的前引物为CCGGATATCATGGAAAATGGAGG(SEQIDNO：5)，后引物为GCCGGAGCTCTTAGTATTCTATTTGC(SEQIDNO：6)。PCR扩增的模板为茶叶cDNA。PCR第一轮扩增程序为：98℃，10s；60℃，15s；72℃，1min，一共35个扩增循环。第二轮PCR扩增程序为：98℃，10s；45℃，15s；72℃，1min，一共2个扩增循环。98℃，10s；65℃，15s；72℃，1min，一共33个扩增循环。得到的CsAAAT1基因克隆进pET32a原核表达载体中。苯丙氨酸转氨酶CsAAAT1的原核表达将构建好的载体CsAAAT1-pET32a转入表达菌株BL21(DE3)后挑取单克隆摇菌。待菌液的OD600约等于0.5时加入终浓度为0.1mM的异丙基硫代半乳糖苷进行蛋白诱导表达。蛋白诱导表达的温度为18℃，诱导时间为18h。重组蛋白CsAAAT1-pET32a的纯化将诱导表达的大肠杆菌BL21(DE3)12,000g离心10min收菌。用Tris-HCl(25mM,pH7.4)重悬，然后进行冰浴超声破碎，超声裂解后12,000g离心30min。上清在4℃条件下和Ni-NTA琼脂糖凝胶孵育1h后上柱纯化。漂洗液(50mMNaH2PO4，300mMNaCl，2本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.由SEQ ID NO：2的氨基酸序列组成的L‑苯丙氨酸转氨酶。
【技术特征摘要】
1.由SEQIDNO：2的氨基酸序列组成的L-苯丙氨酸转氨酶。2.编码由SEQIDNO：2的氨基酸序列组成的L-苯丙氨酸转氨酶的编码基因。3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于：由SEQIDNO：1的核苷酸序列组成的L-苯丙氨酸转氨酶基因。4.生产根据权利要求1所述的L-苯丙氨酸转氨酶的方法，其包括至少如下步骤：1)从至少一种根据权利要求2或3的基因表达多肽的步骤；和2)收集步骤1)中表达的多肽的步骤。5.权利要求1所述的L-苯丙氨酸转氨酶在生产苯丙酮酸中的应用。6.生产苯丙酮酸的方法，其包括在根据权利要求1所述的L-苯丙氨酸转氨酶存在下以L-苯丙氨酸为底物进行体外酶促反应的步骤。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在...
【专利技术属性】
技术研发人员：曾兰亭，王小琴，廖茵茵，杨子银，康明，
申请(专利权)人：中国科学院华南植物园，
类型：发明
国别省市：广东,44
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