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一种斑马鱼胚胎单细胞悬液的制备方法技术

技术编号:20931572 阅读:278 留言:0更新日期:2019-04-20 13:21
本发明专利技术公开了一种斑马鱼胚胎单细胞悬液的制备方法,顺序进行如下步骤:(1)取斑马鱼胚胎,加入Pronase E的水溶液;(2)37℃孵育4~5min;(3)使用2mL一次性滴管轻轻吹吸胚胎使绒毛膜剥落,移入1.5mL无酶离心管中,并快速吸走Pronase E;(4)加入E3培养基洗涤,移除,反复3~5遍;(5)加入冰上预冷的分散酶;(6)37℃孵育2‑5min,孵育期间间歇震荡;(7)加入FBS终止消化;(8)将步骤(7)得到的悬液过70μm筛网,将滤液再过40μm筛网;(9)过筛后的悬液200~500×g离心3~5min;(10)取冰上预冷的含1%的BSA的HBSS重悬细胞;(11)200~500×g离心步骤(10)得到的悬液3~5min;(12)重复步骤(10)和(11)清洗一次;(13)取冰上预冷的IESC重悬细胞,即得。

A preparation method of zebrafish embryo single cell suspension

The invention discloses a preparation method of zebrafish embryo single cell suspension, which is carried out in the following steps: (1) fetching zebrafish embryos and adding the water solution of Pronase E; (2) incubating at 37 ~5 minutes; (3) using a 2 mL disposable dropper to gently suck the embryos to exfoliate the chorion, move them into an 1.5 mL enzymatic centrifuge tube, and quickly suck Pronase E; (4) adding E3 medium to wash, remove and repeat. 3-5 times; (5) adding the pre-cooled dispersing enzymes on ice; (6) incubating at 37 (?) for 2 5 minutes, intermittent oscillation during incubation; (7) adding FBS to stop digestion; (8) passing the suspension obtained by step (7) through a 70-micron sieve and then through a 40-micron sieve; (9) centrifuging the suspension after sieving 200-500 (?) for 3-5 minutes; (10) taking HBSS heavy suspension cells containing 1% BSA pre-cooled on ice; (11) centrifuging with 200-500 (?) (12) Repeat steps (10) and (11) rinse once; (13) Re-suspend IESC cells which are pre-cooled on ice.

【技术实现步骤摘要】
一种斑马鱼胚胎单细胞悬液的制备方法
本专利技术属于生物
,具体涉及一种斑马鱼胚胎单细胞悬液的制备方法。
技术介绍
随着测序技术的发展,测序成本不断下降,转录组学与基因组学等生物组学技术在医学、环境、食品等多领域得到越来越多的应用。但传统的转录组学(BulkRNASeq)与基因组学测序(BulkDNASeq)所获得是生物组织(器官)的整体状态。对组成生物组织(器官)的不同类型细胞进行一个“均一”的分析,并不利于研究复杂的生物过程。尤其是对免疫学,肿瘤学,遗传学的研究来说,传统测序无法获取有效信息。随着MARS-Seq、CytoSeq、Drop-Seq、inDrop等技术的出现,使得对单个细胞内核酸分别测序成为可能,即单细胞测序(SinglecellRNA/DNAseq),而制备一份高质量的单细胞悬液是保障测序质量的决定因素。同时,流式细胞术,原代细胞培养等重要技术手段在应用的过程中,首先也需要制备单细胞悬液。目前单细胞悬液的制备方法主要可以分为酶解法,机械破碎,螯合剂处理以及上述方法组合使用。Farrell等人1通过快速剧烈震荡离心管,将斑马鱼胚胎制成单细胞悬液。机械破碎一般耗时较酶解法短利于提高活力,但细胞分散效果差,多团聚体,并且对细胞造成物理损伤。Raj等人2采用商品化试剂盒制备了斑马鱼脑部组织单细胞悬液,对细胞起分散作用的主要是木瓜蛋白酶。或是多种酶连续配合消解3,常用的酶类有胶原蛋白酶,胰酶,弹性蛋白酶,木瓜蛋白酶以及透明质酸酶等。这类方法制得的细胞分散好,但在每次终止酶消化后均需对细胞进行多次离心洗涤,耗时长,吹吸重悬过程对细胞损伤大。而将机械的方法与酶解或者螯合剂组合使用,能够相对缩短整个悬液制备时间,也较纯机械破碎或酶解法温和。如Spanjaard等人4,采用温和型酶TrypLE孵育,并且每隔5分钟使用移液器对斑马鱼幼鱼、脑部组织以及肝胰腺组织进行吹吸,以制备相应单细胞悬液。Briggs等人5则采用羟乙基磺酸钠(sodiumisethionate)、焦磷酸钠以及CAPS配置而成的缓冲液进行孵育,同时辅以机械涡旋制备了非洲爪蛙胚胎单细胞悬液。悬液的制备方式多种多样,但目前多开发应用于制备人类肿瘤、生物组织(器官)等的单细胞悬液。针对鱼类胚胎制备方法尚且不多,尤其是鱼类胚胎还包被有起保护作用的绒毛膜,需先去除绒毛膜,才能进行后续操作。根据Briggs等人5描述其在分散非洲爪哇胚胎细胞时,尝试了CMFM(calciummagnesiumfreemedia),Newport分散液(Newportdissociationmedia),胰蛋白酶-EDTA,TrypLE,细胞消化液,木瓜蛋白酶和胶原酶等的消解,均未获得较好的结果。可见胚胎细胞分散方法无法全盘借鉴生物组织(器官)分散方法。斑马鱼是一类实验室常用模式生物,由于其便于实验室养殖、繁殖周期短、产卵量大、体外受精与发育、胚体透明,加之其基因组与人类基因组同源性高达70%,这些都使得其具有其他模式生物无可比拟的优势。而胚胎作为生物体发育的起始,能够帮助研究人员探索生物体发育的全过程,必然会在未来得到更多的应用。因此开发一种快速高效的斑马鱼胚胎单细胞悬液制备方法十分有必要。1.Farrell,J.A.;Wang,Y.;Riesenfeld,S.J.;Shekhar,K.;Regev,A.;Schier,A.F.,Single-cellreconstructionofdevelopmentaltrajectoriesduringzebrafishembryogenesis.Science2018,360,(6392),979-+.2.Raj,B.;Wagner,D.E.;McKenna,A.;Pandey,S.;Klein,A.M.;Shendure,J.;Gagnon,J.A.;Schier,A.F.,Simultaneoussingle-cellprofilingoflineagesandcelltypesinthevertebratebrain.NatureBiotechnology2018,36,(5),442-+.3.Magness,S.T.;Puthoff,B.J.;Crissey,M.A.;Dunn,J.;Henning,S.J.;Houchen,C.;Kaddis,J.S.;Kuo,C.J.;Li,L.;Lynch,J.;Martin,M.G.;May,R.;Niland,J.C.;Olack,B.;Qian,D.;Stelzner,M.;Swain,J.R.;Wang,F.;Wang,J.;Wang,X.;Yan,K.;Yu,J.;Wong,M.H.,Amulticenterstudytostandardizereportingandanalysesofffluorescence-activatedcell-sortedmurineintestinalepithelialcells.AmericanJournalofPhysiology-GastrointestinalandLiverPhysiology2013,305,(8),G542-G551.4.Spanjaard,B.;Hu,B.;Mitic,N.;Olivares-Chauvet,P.;Janjuha,S.;Ninov,N.;Junker,J.P.,Simultaneouslineagetracingandcell-typeidentificationusingCRISPR-Cas9-inducedgeneticscars.NatureBiotechnology2018,36,(5),469-+.5.Briggs,J.A.;Weinreb,C.;Wagner,D.E.;Megason,S.;Peshkin,L.;Kirschner,M.W.;Klein,A.M.,Thedynamicsofgeneexpressioninvertebrateembryogenesisatsingle-cellresolution.Science2018,360,(6392),980-+.
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种斑马鱼胚胎单细胞悬液的制备方法,以解决目前未有快速高效的斑马鱼胚胎单细胞悬液制备方法。本专利技术采用分散酶(Dispase),实现了短时间内消化分散斑马鱼胚胎细胞,制备高质量单细胞悬液。为解决上述技术问题,本专利技术采用的技术方案如下:一种斑马鱼胚胎单细胞悬液的制备方法,顺序进行如下步骤:(1)取斑马鱼胚胎,加入PronaseE的水溶液;(2)37℃孵育4~5min;(3)使用2mL一次性滴管轻轻吹吸胚胎使绒毛膜剥落,移入1.5mL无酶离心管中,并快速吸走PronaseE;(4)加入E3培养基洗涤,移除,反复3~5遍;(5)加入冰上预冷的分散酶;(6)37℃孵育2-5min,孵育期间间歇震荡;(7)加入FBS终止消化;(8)将步骤(7)得到的悬液过70μm筛网,将滤液再过40μm筛网;(9)过筛后的悬液200~500×g离心3~5min;(10)取冰上预冷的含1%的BSA的HBSS重悬细胞;(11)200~500×g离心步骤(10)得到的悬液3~5min本文档来自技高网
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【技术保护点】
1.一种斑马鱼胚胎单细胞悬液的制备方法,其特征在于,顺序进行如下步骤:(1)取斑马鱼胚胎,加入Pronase E的水溶液;(2)37℃孵育4~5min;(3)使用2mL一次性滴管轻轻吹吸胚胎使绒毛膜剥落,移入1.5mL无酶离心管中,并快速吸走Pronase E;(4)加入E3培养基洗涤,移除,反复3~5遍;(5)加入冰上预冷的分散酶;(6)37℃孵育2~5min,孵育期间间歇震荡;(7)加入FBS终止消化;(8)将步骤(7)得到的悬液过70μm筛网,将滤液再过40μm筛网;(9)过筛后的悬液200~500×g离心3~5min;(10)取冰上预冷的含1%的BSA的HBSS重悬细胞;(11)200~500×g离心步骤(10)得到的悬液3~5min;(12)重复步骤(10)和(11)清洗一次;(13)取冰上预冷的IESC重悬细胞,即得。

【技术特征摘要】
1.一种斑马鱼胚胎单细胞悬液的制备方法,其特征在于,顺序进行如下步骤:(1)取斑马鱼胚胎,加入PronaseE的水溶液;(2)37℃孵育4~5min;(3)使用2mL一次性滴管轻轻吹吸胚胎使绒毛膜剥落,移入1.5mL无酶离心管中,并快速吸走PronaseE;(4)加入E3培养基洗涤,移除,反复3~5遍;(5)加入冰上预冷的分散酶;(6)37℃孵育2~5min,孵育期间间歇震荡;(7)加入FBS终止消化;(8)将步骤(7)得到的悬液过70μm筛网,将滤液再过40μm筛网;(9)过筛后的悬液200~500×g离心3~5min;(10)取冰上预冷的含1%的BSA的HBSS重悬细胞;(11)200~500×g离心步骤(10)得到的悬液3~5min;(12)重复步骤(10)和(11)清洗一次;(13)取冰上预冷的IESC重悬细胞,即得。2.根据权利要求1所述的斑马鱼胚胎单细胞悬液的制备方法,其特征在于,步骤(1)中,所述的PronaseE的水溶液,PronaseE的浓度为0.5~2.0mg/mL。3.根据权利要求2所述的斑马鱼胚胎单细胞悬液的制备方法,其特征在于,步骤(1)中,...

【专利技术属性】
技术研发人员:吴兵陈玲顾纬卿张徐祥任洪强
申请(专利权)人:南京大学
类型:发明
国别省市:江苏,32

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