The invention discloses a preparation method of zebrafish embryo single cell suspension, which is carried out in the following steps: (1) fetching zebrafish embryos and adding the water solution of Pronase E; (2) incubating at 37 ~5 minutes; (3) using a 2 mL disposable dropper to gently suck the embryos to exfoliate the chorion, move them into an 1.5 mL enzymatic centrifuge tube, and quickly suck Pronase E; (4) adding E3 medium to wash, remove and repeat. 3-5 times; (5) adding the pre-cooled dispersing enzymes on ice; (6) incubating at 37 (?) for 2 5 minutes, intermittent oscillation during incubation; (7) adding FBS to stop digestion; (8) passing the suspension obtained by step (7) through a 70-micron sieve and then through a 40-micron sieve; (9) centrifuging the suspension after sieving 200-500 (?) for 3-5 minutes; (10) taking HBSS heavy suspension cells containing 1% BSA pre-cooled on ice; (11) centrifuging with 200-500 (?) (12) Repeat steps (10) and (11) rinse once; (13) Re-suspend IESC cells which are pre-cooled on ice.
【技术实现步骤摘要】
一种斑马鱼胚胎单细胞悬液的制备方法
本专利技术属于生物
,具体涉及一种斑马鱼胚胎单细胞悬液的制备方法。
技术介绍
随着测序技术的发展,测序成本不断下降,转录组学与基因组学等生物组学技术在医学、环境、食品等多领域得到越来越多的应用。但传统的转录组学(BulkRNASeq)与基因组学测序(BulkDNASeq)所获得是生物组织(器官)的整体状态。对组成生物组织(器官)的不同类型细胞进行一个“均一”的分析,并不利于研究复杂的生物过程。尤其是对免疫学,肿瘤学,遗传学的研究来说,传统测序无法获取有效信息。随着MARS-Seq、CytoSeq、Drop-Seq、inDrop等技术的出现,使得对单个细胞内核酸分别测序成为可能,即单细胞测序(SinglecellRNA/DNAseq),而制备一份高质量的单细胞悬液是保障测序质量的决定因素。同时,流式细胞术,原代细胞培养等重要技术手段在应用的过程中,首先也需要制备单细胞悬液。目前单细胞悬液的制备方法主要可以分为酶解法,机械破碎,螯合剂处理以及上述方法组合使用。Farrell等人1通过快速剧烈震荡离心管,将斑马鱼胚胎制成单细胞悬液。机械破碎一般耗时较酶解法短利于提高活力,但细胞分散效果差,多团聚体,并且对细胞造成物理损伤。Raj等人2采用商品化试剂盒制备了斑马鱼脑部组织单细胞悬液,对细胞起分散作用的主要是木瓜蛋白酶。或是多种酶连续配合消解3,常用的酶类有胶原蛋白酶,胰酶,弹性蛋白酶,木瓜蛋白酶以及透明质酸酶等。这类方法制得的细胞分散好,但在每次终止酶消化后均需对细胞进行多次离心洗涤,耗时长,吹吸重悬过程对细胞损伤大。而将 ...
【技术保护点】
1.一种斑马鱼胚胎单细胞悬液的制备方法,其特征在于,顺序进行如下步骤:(1)取斑马鱼胚胎,加入Pronase E的水溶液;(2)37℃孵育4~5min;(3)使用2mL一次性滴管轻轻吹吸胚胎使绒毛膜剥落,移入1.5mL无酶离心管中,并快速吸走Pronase E;(4)加入E3培养基洗涤,移除,反复3~5遍;(5)加入冰上预冷的分散酶;(6)37℃孵育2~5min,孵育期间间歇震荡;(7)加入FBS终止消化;(8)将步骤(7)得到的悬液过70μm筛网,将滤液再过40μm筛网;(9)过筛后的悬液200~500×g离心3~5min;(10)取冰上预冷的含1%的BSA的HBSS重悬细胞;(11)200~500×g离心步骤(10)得到的悬液3~5min;(12)重复步骤(10)和(11)清洗一次;(13)取冰上预冷的IESC重悬细胞,即得。
【技术特征摘要】
1.一种斑马鱼胚胎单细胞悬液的制备方法,其特征在于,顺序进行如下步骤:(1)取斑马鱼胚胎,加入PronaseE的水溶液;(2)37℃孵育4~5min;(3)使用2mL一次性滴管轻轻吹吸胚胎使绒毛膜剥落,移入1.5mL无酶离心管中,并快速吸走PronaseE;(4)加入E3培养基洗涤,移除,反复3~5遍;(5)加入冰上预冷的分散酶;(6)37℃孵育2~5min,孵育期间间歇震荡;(7)加入FBS终止消化;(8)将步骤(7)得到的悬液过70μm筛网,将滤液再过40μm筛网;(9)过筛后的悬液200~500×g离心3~5min;(10)取冰上预冷的含1%的BSA的HBSS重悬细胞;(11)200~500×g离心步骤(10)得到的悬液3~5min;(12)重复步骤(10)和(11)清洗一次;(13)取冰上预冷的IESC重悬细胞,即得。2.根据权利要求1所述的斑马鱼胚胎单细胞悬液的制备方法,其特征在于,步骤(1)中,所述的PronaseE的水溶液,PronaseE的浓度为0.5~2.0mg/mL。3.根据权利要求2所述的斑马鱼胚胎单细胞悬液的制备方法,其特征在于,步骤(1)中,...
【专利技术属性】
技术研发人员:吴兵,陈玲,顾纬卿,张徐祥,任洪强,
申请(专利权)人:南京大学,
类型:发明
国别省市:江苏,32
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