细胞共培养下生长缺陷的牛支原体突变株及应用制造技术

技术编号:20931557 阅读:31 留言:0更新日期:2019-04-20 13:21
本发明专利技术属于动物传染病防制技术领域,具体涉及细胞共培养下生长缺陷的牛支原体突变株及应用,从牛支原体基因突变体库中筛选得到一株牛支原体Mbov_0328基因缺失突变菌株T9.386,该基因编码环二核苷酸磷酸二酯酶。突变菌株与牛胚胎肺细胞共培养时,表现出显著生长缺陷表型;在PPLO固体培养基上表现为小菌落形态。所述的突变株与野生菌株间的蛋白组学呈现显著的差异表达谱。突变菌株间具有38个差异表达蛋白,其中30个蛋白呈上调表达,8个蛋白呈下调表达。该突变株可在牛支原体代谢生理、致病和免疫防制领域应用。

Mycoplasma bovis mutant strain with growth deficiency under co-culture and its application

The invention belongs to the field of animal infectious disease prevention and control technology, and specifically relates to the growth defective Mycoplasma bovis mutant strain under co-culture and its application. A Mycoplasma bovis Mbov_0328 gene deletion mutant strain T9.386 is screened from the Mycoplasma bovis gene mutant library, which codes for cyclic dinucleotide phosphodiesterase. When the mutant strain was co-cultured with bovine embryonic lung cells, it showed significant growth defect phenotype and small colony morphology on PPLO solid medium. The proteomics between the mutant strain and the wild strain showed significant differential expression profiles. There were 38 differentially expressed proteins among mutant strains, of which 30 were up-regulated and 8 were down-regulated. The mutant can be used in metabolic physiology, pathogenicity and immune control of Mycoplasma bovis.

【技术实现步骤摘要】
细胞共培养下生长缺陷的牛支原体突变株及应用
本专利技术属于动物传染病防制
,具体涉及到细胞共培养下生长缺陷的牛支原体突变株及应用。从牛支原体基因突变体库中筛选得到一株牛支原体Mbov_0328基因缺失突变菌株T9.386,该基因编码环二核苷酸磷酸二酯酶(CDNPase)。突变菌株与牛胚胎肺细胞(EBL)共培养时,表现出显著的生长缺陷表型,在PPLO固体培养基上表现为小菌落形态。所述的突变株与野生菌株间的蛋白组学呈现显著的差异表达谱。该突变株可望在牛支原体致病和免疫防制中应用。
技术介绍
牛支原体(Mycoplasmabovis,M.bovis)是牛的一种重要病原体,可以引起牛的肺炎、关节炎、乳腺炎及角膜结膜炎等症状。牛支原体于1961年首次在美国从患乳腺炎奶牛的牛奶中分离得到,1976年证实其是导致肺炎。任何月龄肉牛和奶牛对该病均易感。牛支原体肺炎的发病率可达80%,平均病死率为10%。目前,牛支原体病在世界范围内广泛流行,已成为危害养牛业的主要传染病和常发病,给全球养牛业带来了严重的经济损失。美国每年由于牛支原体感染所致牛呼吸系统疾病和乳腺疾病造成的损失达1.4亿美元,单个牛场最高感染率可达70%(Rosengarten等,1999)。在英国,每年约有190万头牛患牛支原体肺炎,导致的经济损失达到5400万英镑(Nicholas&Ayling,2003)。2008年,湖北省从外地引进的肉牛中爆发呼吸道疾病,牛群引进后2周左右发病,表现为发热,咳嗽,流鼻涕,犊牛和体质弱的牛发病严重。华中农业大学农业微生物学国家重点实验室反刍动物病原分室通过病原分离鉴定,在全国确定该病为“传染性牛支原体肺炎”。此后牛支原体肺炎被报道呈全国性流行,主要发生在新引入的育肥牛中,一般在引入后10-15天左右发病,发病率为80%以上。该病临床治疗效果差,病程长,病死率高,平均为10%,高达到60%(石磊等,2008)。该病的发生与我国肉牛养殖产业化的快速发展直接相关。由于我国养牛业向规模化和集约化发展,牛养殖量大大增加,专门化程度大幅度提高,肉牛“异地育肥”已经成为重要的肉牛养殖模式,全国出现大规模的“北牛南调、西牛东运”的牛群转运现象。架子牛反复倒运引起的运输应激成了该病暴发流行的诱因(郭爱珍等,2011)。与此同时,因奶牛牛支原体乳腺炎导致初生犊牛牛支原体肺炎的流行,给奶牛业带来重大损失。然而,由于支原体本身的生物学特征及研究手段有限,50多年来一直缺乏针对该病原体的特异性防控手段,既无有效疫苗也无特效药物。阐明其毒力机制和致病机理是研究特效防治措施的前提条件。但目前对牛支原体的毒力机制仍知之甚少,尚未发现其具有经典的毒素和毒力因子和毒力岛。为发掘牛支原体的毒力基因,申请人构建了牛支原体突变体库,利用细胞共培养存活模型、细胞黏附和侵袭模型等,鉴定了一系列相关基因的突变体。本专利技术涉及一株与牛胚胎肺细胞共培养时存活能力缺陷的突变体,确定其突变基因为Mbov_0328,该基因编码蛋白为环二核苷酸磷酸二酯酶(CDNPase)。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的缺陷,提供一株牛支原体Mbov_0328基因突变菌株。该基因的编码蛋白为环二核苷酸磷酸二酯酶(CDNPase)。与野生菌株比较,突变菌株与牛胚胎肺细胞共培养时,呈现出显著的生长缺陷,在PPLO固体培养基上呈现小菌落表型,表现显著的蛋白组差异表达。有研究表明该突变菌株生长缺陷表型与缺失基因的酶活性相关。基于牛支原体与细胞共培养下的存活能力与毒力相关,该突变株可望在牛支原体致病、生理代谢和免疫防制等领域有潜在应用前景。为了实现本专利技术的目的,申请人所在的华中农业大学农业微生物学国家重点实验室反刍动物病原分室从牛支原体全基因组的突变体库中筛选得到一株生长缺陷型菌株(T9.386),该菌株含有突变基因Mbov_0328,其核苷酸序列如SEQIDNO:1所示,序列长度为969bp,其编码的蛋白质序列如SEQIDNO:2-7所示,该蛋白具有环二核苷酸磷酸二酯酶(CDNPase)和小片段核酸酶的功能。经验证,在PPLO培养基中,该突变菌株在对数生长期的生长速度比牛支原体野生菌株显著减慢。在牛胚胎肺细胞(EBL)的培养中,所述的突变菌株T9.386呈现显著的生长缺陷表型。同时,在PPLO固体培养基上,与野生菌相比,突变菌株呈现小菌落。突变菌株表型与突变基因的关系研究显示其生长缺陷表型与CDNPase酶的活性相关。比较蛋白组学分析显示,突变菌株较野生株存在38个差异表达蛋白(p<0.05),其中30个蛋白呈上调表达,8个蛋白呈下调表达。环二核苷酸是致病菌十分重要的第二信使,对细菌生理活动及毒力具有广泛的调控功能。环二核苷酸磷酸二酯酶是调节环二核苷酸代谢平衡的关键因子,且主要通过环二核苷酸发挥全局性调节功能。因此,本专利技术的牛支原体突变体的成功构建和鉴定可望在牛支原体生理、致病以免疫防制具有潜在的应用价值。本专利技术的技术方案如下所述:申请人于2008年6月从湖北省应城市某养牛场发病的黄牛肺组织中分离得到一株牛支原体本地分离株HB0801,将其命名为牛支原体HB0801,MycoplasmabovisHB0801,于2010年2月1日送交中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏,保藏编号为CCTCCNO:M2010040。由于牛支原体定点突变效率十分低,很难获得预期的突变菌株。本专利技术以牛支原体HB0801(基因组在GenBank上的登录号为CP002058)为亲本菌株,利用PEG介导的转化方法,将含有转座子的pMT85质粒转化到牛支原体中,利用庆大霉素做抗性筛选标志,对突变菌株进行筛选,成功构建了牛支原体突变体库。本专利技术使用的牛支原体细胞共培养模型是从突变体库中筛选出的一株生长缺陷型突变株T9.386,申请人将该突变株命名为牛支原体T9.386,MycoplasmabovisT9.386,于2018年8月31日送交中国典型培养物保藏中心保藏,保藏编号为CCTCCNO:M2018583。将该突变菌株T9.386与野生株(即本地分离株)MycoplasmabovisHB0801菌株分别接种于PPLO培养基中,进行生长曲线检测,结果显示突变菌株T9.386在对数生长期生长较减慢,在其他阶段与野生菌株没有显著差异。将突变菌株T9.386和野生型菌株HB0801涂布于PPLO固体培养基中,通过菌落形态观察显示,突变菌株的菌落明显变小。本专利技术构建的突变菌株的突变基因为Mbov_0328基因(其核苷酸序列如SEQIDNO:1所示),该基因编码蛋白具有环二核苷酸磷酸二酯酶(CDNPase)和小片段核酸酶活性,可以将环二核苷酸(CDNs)和nanoRNA(pApA/pGpG)最终降解成AMP和GMP,经验证突变菌株与细胞共培养时的生长缺陷表型与缺失基因的酶活性相关。将牛支原体HB0801和T9.386分别与EBL细胞共培养,人工添加核苷混合物(例如AMP,GMP,CMP,UMP)或核苷酸混合物(例如腺嘌呤,鸟嘌呤,胞嘧啶,尿嘧啶)至共培养体系中,同时设定不含人工添加核酸或核苷酸的组为对照组,对牛支原体的生长情况进行分析。结果显示:突变菌株出现生长缺陷,人工添加核苷或核苷酸后,突本文档来自技高网
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【技术保护点】
1.一株包含如序列表SEQ ID NO:1所示的突变基因Mbov_0328,编码环二核苷酸磷酸二酯酶CDNPase的牛支原体突变菌株T9.386,其特征在于,保藏在中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCC NO:M2018583。

【技术特征摘要】
1.一株包含如序列表SEQIDNO:1所示的突变基因Mbov_0328,编码环二核苷酸磷酸二酯酶CDNPase的牛支原体突变菌株T9.386,其特征在于,保藏在...

【专利技术属性】
技术研发人员:郭爱珍朱习芳董亚旗李茜茜陈颖钰胡长敏陈焕春
申请(专利权)人:华中农业大学
类型:发明
国别省市:湖北,42

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