一种特异性识别肿瘤细胞的重组融合蛋白及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种重组融合蛋白，涉及基因工程技术领域，包括冰核蛋白N端结构域和T抗原结合短肽。其中，冰核蛋白N端结构域提供细菌表面锚定功能，能够使融合蛋白锚定和展示在细胞表面；T抗原结合短肽是一段能够与肠道肿瘤细胞表面T抗原特异性结合的寡肽。本发明专利技术将T抗原结合短肽以融合蛋白方式展示于细菌表面。这一策略可实现细菌对肠道肿瘤的特异性识别，解决了现有肠道探查与检测技术必须侵入体内的局限，为进一步研制用于肠道肿瘤早期诊断和治疗的靶向药物奠定了基础。

A Recombinant Fusion Protein Specifically Recognizing Tumor Cells and Its Application

The invention discloses a recombinant fusion protein, which relates to the field of genetic engineering technology, including an N-terminal domain of ice nucleoprotein and a T-antigen binding short peptide. Among them, the N-terminal domain of ice nucleoprotein provides the function of bacterial surface anchoring, enabling the fusion protein to anchor and display on the cell surface; T-antigen binding short peptide is an oligopeptide that can specifically bind to T-antigen on the surface of intestinal cancer cells. The invention displays T antigen binding short peptide on bacterial surface in the form of fusion protein. This strategy can realize the specific recognition of intestinal tumors by bacteria and overcome the limitation that the existing intestinal exploration and detection technology must invade the body. It lays a foundation for further development of targeted drugs for early diagnosis and treatment of intestinal tumors.

【技术实现步骤摘要】
一种特异性识别肿瘤细胞的重组融合蛋白及其应用
本专利技术涉及基因工程
，尤其涉及一种基于细菌表面展示系统的重组融合蛋白及其应用。
技术介绍
当前，恶性肿瘤是极大危害人类生命健康的严重疾病。近年来随着肿瘤生物学和免疫学等基础研究的进步，肿瘤手术、化疗、放疗及生物治疗的疗效在某些类型的肿瘤中已经有显著提高，但肿瘤患者生存率提高的关键仍有赖于肿瘤的早期发现和早期诊断。结直肠癌(Colorectalcancer，简称CRC)是人类第三大常见癌症，占所有癌症的9.7％，其中一半以上的病例发生在世界发达地区，原因是老年人口增多、不健康的饮食习惯以及环境风险因素的不断增加。近年来，我国结肠癌的发病率和死亡率也在急剧上升。在上海等一些发达城市，结直肠癌的发病率在所有癌症中已经上升到第二位，在农村地区，结直肠癌的发病率也已跃居到第五位。早期筛查对遏制结直肠癌的进展具有重要意义，病灶越早被诊断出来，就能越快地得到正确的治疗。然而现有的结肠镜检查方法主要为侵入式肠镜检查，一方面，这种检查方法检验诊断流程复杂，成本高且容易引起被检查者不适，并且常规体检项目中也不包含该检查，普通人主动进行肠镜检察的意愿非常低，导致很难将侵入式肠镜检查作为一种适用广泛的结直肠癌诊断筛查方法；另一方面，肠道肿瘤的早期症状通常不明显，侵入式肠镜检查在早期结直肠癌中的诊断作用也有其局限性，综上原因目前早期的结肠癌筛查仍然有限。肿瘤诊断的关键是发现适当的肿瘤标志物，这其中肿瘤抗原及其相应抗体是重要的肿瘤诊断标志物。针对结直肠癌进行靶向的抗原包括存在于CRC的大量抗原，如CEA和EGFR，但是肠道中的粘液层会阻止了癌细胞和靶向药物之间的直接接触。因此，本领域的技术人员致力于开发一种能够特异性识别肿瘤细胞的重组融合蛋白及其应用。
技术实现思路
有鉴于现有技术的上述缺陷，本专利技术所要解决的技术问题是现有的结直肠癌早期诊断技术操作门槛高，成本高，缺乏能够特异性识别肠道肿瘤的基因工程手段。为实现上述目的，本专利技术提供了一种重组融合蛋白，包括冰核蛋白N端结构域和肿瘤细胞T抗原结合肽，编码肿瘤细胞T抗原结合肽的核苷酸序列如SEQIDNO：4所示。进一步地，冰核蛋白N端结构域包含3或4个跨膜区。进一步地，冰核蛋白N端结构域来自于丁香假单胞菌(Pseudomonassyringae)、草生欧文氏菌(Erwiniaherbicola)和野油菜黄单胞菌(Xanthomonascampestris)中的任意一种。进一步地，编码冰核蛋白N端结构域的核苷酸序列如SEQIDNO：3所示。进一步地，编码重组融合蛋白的核苷酸序列如SEQIDNO：5所示。在另一较佳实施方式中，本专利技术还提供了上述融合蛋白在制备治疗肿瘤的靶向药物或制备用于结肠镜检查的光学成像剂中的应用。在另一较佳实施方式中，本专利技术还提供了一种重组菌的构建方法，包括如下步骤：(1)利用分子克隆技术获得SEQIDNO：5所示的核苷酸序列；(2)酶切连接构建含SEQIDNO：5所示核苷酸序列的重组表达载体；(3)将步骤(2)所得的重组表达载体与含有编码荧光蛋白的核苷酸序列的表达载体共转化宿主菌；(4)酶切电泳筛选含有SEQIDNO：5所示核苷酸序列和编码荧光蛋白的核苷酸序列的宿主菌；(5)诱导筛选得到的宿主菌表达SEQIDNO：5所示核苷酸序列编码的重组融合蛋白和所述荧光蛋白。进一步地，步骤(1)中PCR所用引物序列如SEQIDNO：1和SEQIDNO：2所示。进一步地，宿主菌为大肠杆菌。在另一较佳实施方式中，本专利技术还提供了一种重组菌，所述重组菌由上述方法制备所得。进一步地，重组菌为同时表达上述重组融合蛋白和绿色荧光蛋白的大肠杆菌。本专利技术提供的重组融合蛋白，该重组融合蛋白基于细菌表面展示系统，以冰核蛋白(IceNucleationProtein，INP)N端结构域为细菌表面锚定元件，以肠道肿瘤T抗原(Thomsen-Friedenreich，以下称为T抗原)结合短肽为特异识别并结合肿瘤细胞的功能区。其中，冰核蛋白是发现于丁香假单胞菌(Pseudomonassyringae)、草生欧文氏菌(Erwiniaherbicola)和野油菜黄单胞菌(Xanthomonascampestris)等革兰氏阴性菌中的一种分泌型表面蛋白，可加速纯水的冰晶形成。所有的冰核蛋白(INP)都是由三个不同的结构域组成的，包括N端结构域(15％)，C端结构域(4％)和中央重复域(81％)。其中包含3-4个跨膜区的N端结构域负责靶向定位至细胞表面，即冰核蛋白(INP)N端结构域提供细菌表面锚定功能，能够使融合蛋白锚定和展示在细胞表面。T抗原结合短肽则是一段能够与肠道肿瘤细胞表面T抗原特异性结合的寡肽，T抗原是与肠道黏液层相关的抗原，是大多数CRC细胞特异性分泌的黏蛋白的抗原表位。因此本专利技术提供的重组融合蛋白中的T抗原结合短肽与肠道肿瘤细胞表面T抗原的特异结合克服了现有技术中靶向药物与肠道肿瘤细胞抗原(如CEA和EGFR等)之间的接触受到黏液层阻碍的缺陷。将上述融合蛋白转化具有荧光报告系统的细菌，例如能够表达绿色荧光蛋白的大肠杆菌，使得上述肠道肿瘤T抗原结合短肽通过冰核蛋白(INP)表面展示系统锚定在菌体表面，T抗原结合短肽特异识别并结合道肿瘤细胞表面的T抗原，进一步通过菌体的荧光报告系统实现对肿瘤的特异识别和诊断。本专利技术将T抗原结合短肽以融合蛋白方式展示于细菌表面，这一策略可实现细菌对肠道肿瘤的特异性识别，提供了一种用于操作更加简便、成本低、无创无痛的肠道检察的重组细菌，解决了现有肠道探查与检测技术必须侵入体内的局限，也为进一步研制用于肠道肿瘤早期诊断和治疗的靶向药物和光学成像剂奠定了基础。以下将结合附图对本专利技术的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本专利技术的目的、特征和效果。附图说明图1是本专利技术的一个实施例中重组细菌与HT29细胞特异性结合的荧光显微镜观察图；图2是本专利技术的一个实施例中重组细菌与HT29细胞特异性结合的荧光信号的数量统计。图3是本专利技术的一个实施例中重组细菌与HT29细胞特异性结合的流式细胞分析结果图；图4是本专利技术的一个实施例中结直肠癌造模小鼠肿瘤部位和非肿瘤部位的组织切片荧光显微镜观察图；图5是本专利技术的一个实施例中结直肠癌造模小鼠肿瘤部位和非肿瘤部位的重组细菌数量统计图；图6是本专利技术的一个实施例中重组细菌与小鼠结直肠组织的特异性结合数量统计图；图7是本专利技术的一个实施例的重组细菌与小鼠结直肠组织特异结合的组织切片荧光显微镜观察图。其中，星号：绿色荧光蛋白(EGFP)显色点；箭头：特异性结合的重组细菌；三角：背景信号；虚线(ROI)：重点关注区域。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术的
技术实现思路
做进一步的说明：下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本专利技术的保护范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册见NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress的1989年版中所述的条件，或按照制造厂商所本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种重组融合蛋白，其特征在于，包括冰核蛋白N端结构域和肿瘤细胞T抗原结合肽，编码所述肿瘤细胞T抗原结合肽的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。

【技术特征摘要】
2018.10.18 CN 20181121521261.一种重组融合蛋白，其特征在于，包括冰核蛋白N端结构域和肿瘤细胞T抗原结合肽，编码所述肿瘤细胞T抗原结合肽的核苷酸序列如SEQIDNO：4所示。2.如权利要求1所述的重组融合蛋白，其特征在于，所述冰核蛋白N端结构域包含3或4个跨膜区。3.如权利要求2所述的重组融合蛋白，其特征在于，所述冰核蛋白N端结构域来自于丁香假单胞菌(Pseudomonassyringae)、草生欧文氏菌(Erwiniaherbicola)和野油菜黄单胞菌(Xanthomonascampestris)中的任意一种。4.如权利要求3所述的重组融合蛋白，其特征在于，编码所述冰核蛋白N端结构域的核苷酸序列如SEQIDNO：3所示。5.如权利要求1所述的重组融合蛋白，其特征在于，编码所述重组融合蛋白的核苷酸序列如SEQIDNO：5所示。6.一种如权...

【专利技术属性】
技术研发人员：马钢，王毓舒，洪艺瑞，梁智涵，孙诗语，郑书钰，方清伟，冉运聪，刘致祥，萧家宜，钟博子韬，何沛祥，张凯然，夏若瑜，吴蔚文，姚宽，贺林，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：上海,31