一种快速获得抗原特异性抗体的方法技术

本发明专利技术提供了一种快速获得抗原特异性抗体的方法，包括：建立抗体与多肽、基序的对应关系；通过搜索抗体与多肽的对应关系，查找与目标蛋白质氨基酸序列一致的多肽，其对应的抗体即为抗原特异性抗体；或计算所述抗体与基序的对应关系中，每一抗体的所有基序与目标蛋白质所有模块的相似度，取其中相似度值大于0.4所对应的基序，其对应的抗体即为抗原特异性抗体。本发明专利技术联合噬菌体展示技术和高通量测序技术，可以高效全局性地获取给定抗体所能特异性识别的多肽或基序信息，建立抗体与多肽或基序的对应关系，通过该对应关系，可快速确定目标蛋白质所对应的特异性抗体，具有十分广阔的应用前景。

A Rapid Method for Obtaining Antigen Specific Antibodies

The invention provides a method for quickly obtaining antigen-specific antibodies, including: establishing the corresponding relationship between antibodies and polypeptides and motifs; searching the corresponding relationship between antibodies and polypeptides to find polypeptides consistent with the amino acid sequence of the target protein, and the corresponding antibodies are antigen-specific antibodies; or calculating the corresponding relationship between the antibodies and motifs, all of each antibody. The similarity between the motif and all the modules of the target protein is taken, and the corresponding motif whose similarity value is greater than 0.4 is the antigen-specific antibody. Combining phage display technology and high throughput sequencing technology, the present invention can efficiently and globally acquire the information of polypeptides or motifs that can be specifically recognized by a given antibody, and establish the corresponding relationship between the antibody and the polypeptide or motifs. Through the corresponding relationship, the specific antibody corresponding to the target protein can be quickly determined, which has a very broad application prospect.

【技术实现步骤摘要】
一种快速获得抗原特异性抗体的方法
本专利技术涉及抗体
，具体涉及一种快速获得抗原特异性抗体的方法。
技术介绍
抗体是生命科学、医学、药学等相关领域最重要的试剂和药物之一，发挥着不可替代的作用。抗体目前主要是通过免疫动物获得。抗体包括抗体组份单一的单克隆抗体、工程化抗体以及修饰抗体等，也包括抗体组份复杂的多克隆抗体。其中，多克隆抗体的组成复杂、重现性低等限制了其应用范围。目前，获得单一组份抗体的主要方式为杂交瘤技术(Nature1975,256,495-497)；生物淘选抗体展示文库(NatureBiotechnology1996,14,309-314.)等，但是这些技术费时费力，难以获得抗体所识别的序列信息，这限制了抗体的进一步应用。从杂交瘤技术专利技术至今，已经产生了无数个杂交瘤细胞系，能够产生识别既定靶标的抗体；长期以来，学术界认识到单一组份抗体具有多特异性(Science2003,299,1362-1367)，即可以识别多种不同的多肽序列。少数杂交瘤细胞系产生的抗体，由于其所识别的抗原关注度高，而得到了广泛的应用。但绝大多数单一组分抗体，因其识别的多肽序列或基序不明，并未得到充分的利用。如能利用抗体的多特异性，解出单一组份抗体所能识别的多肽，进而计算出基序，构建抗体-多肽或者抗体-基序对应关系。通过搜索抗体-多肽或者抗体-基序的对应关系，可实现抗原特异性抗体的高效、快速获取。同时，单一组份抗体将得到充分的利用，但目前并未有任何相关报道。AchimKrame等人采用SPOT技术，解析了一种单一组份抗体识别的多肽序列信息和基序，并拓展了该抗体的应用范围(Cell1997,91,799-809)。但是SPOT技术，需要合成大量的多肽，成本较高，耗时，费力。另外，AchimKrame等人只解析了一种抗体识别的多肽序列，只能拓展该抗体的应用范围，没有提及建立抗体-多肽或基序关系和抗原特异性抗体的快速获取。RobertoDiNiro等人联合噬菌体展示技术和高通量测序技术，解析获得了与靶标蛋白相互作用的大量蛋白质(Nucleicacidsresearch2010,38,e110)。没有涉及到解析与抗体相互作用的多肽或蛋白质，也没有涉及抗原特异性抗体的快速获取。EmmanuelDias-Neto等人联合噬菌体展示技术和高通量测序技术，解析获得了与不同组织等复杂样品相互作用的多肽(PLoSONE2009,4:e8338)。没有涉及到解析与抗体相互作用的多肽或蛋白，也没有涉及抗原特异性抗体的快速获取。ArieRyvkin等人联合噬菌体展示技术和高通量测序技术，解析获得了与单克隆抗体和多克隆抗体相互作用的大量多肽(PLoSONE2012,7:e41469)。没有提及建立抗体-多肽或基序关系，并利用其进行抗原特异性抗体的获取。XinyueLiu等人联合噬菌体展示技术和高通量测序技术，解析获得了与多克隆抗体相互作用的大量多肽(PLoSONE2013,8:e67181)。没有提及建立抗体-多肽或基序关系，并利用其进行抗原特异性抗体的获取。YaelWeiss-Ottolenghi等人总结了解析多克隆抗体组成的策略(FEBSLetters2014,588:318-325)。没有提及建立抗体-多肽或基序关系，并利用其进行抗原特异性抗体的获取。GeorgeJ.Xu等人联合噬菌体展示技术和高通量测序技术，解析获得了与多克隆抗体相互作用的大量多肽(Science2015,348:1105)。没有提及建立抗体-多肽或基序关系，并利用其进行抗原特异性抗体的获取。国际专利(WO2015/155035A1)公开了一种解析抗原表位的策略和方法。没有提及建立抗体-多肽或基序关系，并利用其进行抗原特异性抗体的获取。国际专利(WO2015076355A1)公开了一种解析靶标结合多肽的策略和方法。没有提及建立抗体-多肽或基序关系，并利用其进行抗原特异性抗体的获取。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是，针对现有技术不足，提供一种快速获得抗原特异性抗体的方法。本专利技术通过获得抗体结合的多肽或基序，建立抗体-多肽或基序对应关系，为抗原特异性抗体的快速获取提供解决方案。且本专利技术具有通用性，将对抗原特异性抗体的快速获取等产生重要影响。本专利技术的目的是通过以下技术方案实现的：本专利技术提供了一种快速获得抗原特异性抗体的方法，包括以下步骤：A、建立抗体与多肽、基序的对应关系；B、通过搜索抗体与多肽的对应关系，查找与目标蛋白质氨基酸序列一致的多肽，其对应的抗体即为抗原特异性抗体；或计算所述抗体与基序的对应关系中，每一抗体的所有基序与目标蛋白质所有模块的相似度，取其中相似度值大于0.4所对应的基序，其对应的抗体即为抗原特异性抗体。优选地，步骤A中，所述抗体与多肽的对应关系的建立方法包括以下步骤：通过免疫沉淀法，从噬菌体展示多肽文库中，富集能够与抗体样本相互作用的噬菌体，采用高通量测序技术，分别计算所有抗体样本中，每一多肽的富集倍数、所有抗体样本的噪音，去除不能与对应抗体样本相互作用的多肽序列，从而获得抗体样本识别的多肽序列，即得抗体与多肽的对应关系。优选地，所述噬菌体展示多肽文库包括但不局限于随机多肽文库、人为设计的多肽文库；更优选随机多肽文库；最优选NEB公司的Ph.D.TM-12随机多肽文库。优选地，所述噬菌体展示多肽文库，其多肽长度为7～100个氨基酸残基。优选地，所述不能与对应抗体相互作用的多肽序列的去除方法为：通过以下公式(1)和(2)计算每一多肽的富集倍数、抗体样本的噪音，将每一抗体样本中，噪音的3倍设为阈值，每一抗体样本中，富集倍数高于阈值的多肽，为对应抗体样本结合的多肽；否则为不能与对应抗体样本结合的多肽，应去除；其中，f多肽X为给定抗体样本富集的所有多肽序列中，多肽X出现的频率(frequency)；F多肽X为空白对照非特异性结合的所有多肽序列中，多肽X出现的频率(Frequency)；S多肽X为多肽X被对应抗体的富集倍数(Signal)；其中，N为噪音(Noise)，Smin为给定抗体所富集的多肽序列中，最小的富集倍数。优选地，所述采用高通量测序技术时，采用两步PCR法构建高通量测序文库。优选地，所述高通量测序平台是Illumina公司的NextSeq500高通量测序仪；所述NextSeq500高通量测序仪中使用的是2X150bp的测序模式。优选地，所述构建高通量测序文库时采用双重Index标记方法；在第一步延伸PCR时添加第一重Index，在第二步延伸PCR时添加第二重Index。根据Index的组合，拆分不同抗体样本对应的高通量测序数据，并弃去不属于任何Index组合的测序数据。优选地，步骤A中，还包括将高通量测序数据采用标准密码子表转换成对应的氨基酸序列的步骤，如某个多肽序列中出现终止密码子，则丢弃该序列。优选地，所述PCR扩增时使用的是NEB公司的Q5热启动高保真DNA聚合酶。优选地，采用表3中的一种引物(SEQIDNo.1～SEQIDNo.16)和表4中的一种引物(SEQIDNo.17～SEQIDNo.32)，进行一个样本的第一步延伸PCR。其中，在第二重Index相同，且无法实现物理隔离的前提下，一种引物组合只能用于一个样本的第一步延本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种快速获得抗原特异性抗体的方法，其特征在于，包括以下步骤：A、建立抗体与多肽、基序的对应关系；B、通过搜索抗体与多肽的对应关系，查找与目标蛋白质氨基酸序列一致的多肽，其对应的抗体即为抗原特异性抗体；或计算所述抗体与基序的对应关系中，每一抗体的所有基序与目标蛋白质所有模块的相似度，取其中相似度值大于0.4所对应的基序，其对应的抗体即为抗原特异性抗体。

【技术特征摘要】
1.一种快速获得抗原特异性抗体的方法，其特征在于，包括以下步骤：A、建立抗体与多肽、基序的对应关系；B、通过搜索抗体与多肽的对应关系，查找与目标蛋白质氨基酸序列一致的多肽，其对应的抗体即为抗原特异性抗体；或计算所述抗体与基序的对应关系中，每一抗体的所有基序与目标蛋白质所有模块的相似度，取其中相似度值大于0.4所对应的基序，其对应的抗体即为抗原特异性抗体。2.根据权利要求1所述的快速获得抗原特异性抗体的方法，其特征在于，步骤A中，所述抗体与多肽的对应关系的建立方法包括以下步骤：通过免疫沉淀法，从噬菌体展示多肽文库中，富集能够与抗体样本相互作用的噬菌体，采用高通量测序技术，分别计算所有抗体样本中，每一多肽的富集倍数、所有抗体样本的噪音，去除不能与对应抗体样本相互作用的多肽序列，从而获得抗体样本识别的多肽序列，即得抗体与多肽的对应关系。3.根据权利要求2所述的快速获得抗原特异性抗体的方法，其特征在于，所述不能与对应抗体样本相互作用的多肽序列的去除方法为：通过以下公式(1)和(2)计算每一多肽的富集倍数、抗体样本的噪音，将每一抗体样本中，噪音的3倍设为阈值，每一抗体样本中，富集倍数高于阈值的多肽，为对应抗体样本结合的多肽；否则为不能与对应抗体样本结合的多肽，应去除；其中，f多肽X为给定抗体样本富集的所有多肽序列中，多肽X出现的频率；F多肽X为空白对照非特异性结合的所有多肽序列中，多肽X出现的频率；S多肽X为多肽X被对应抗体样本的富集倍数；其中，N为噪音，Smin为给定抗体样本所富集的多肽序列中，最小的富集倍数。4.根据权利要求2所述的快速获得抗原特异性抗体的方法，其特征在于，所述采用高通量测序技术时，采用两步PCR法构建高通量测序文库。5.根据权利要求4所述的快速获得抗原特异性抗体的方法，其特征在于，所述构建高通量测序文库时采用双重Index标记方法；在第一步延伸PCR时...

【专利技术属性】
技术研发人员：陶生策，祁环，赵小东，李华，胡传圣，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：上海,31