一种检测细胞内质网半胱氨酸的荧光探针及其合成和应用制造技术

本发明专利技术提供了一种检测细胞内质网半胱氨酸的比值型荧光探针，结构式为

A Fluorescent Probe for Detecting Cysteine in Endoplasmic Reticulum and Its Synthesis and Application

The present invention provides a ratio fluorescent probe for detecting intracellular endoplasmic reticulum cysteine. The structure of the probe is as follows:

【技术实现步骤摘要】
一种检测细胞内质网半胱氨酸的荧光探针及其合成和应用
本专利技术属于有机小分子荧光探针领域，具体涉及一种基于萘酰亚胺衍生物的检测细胞内质网内半胱氨酸荧光探针及其合成方法。
技术介绍
内质网广泛存在于除哺乳动物的各种真核细胞中，是生物细胞内除核酸以外许多重要生物大分子，如蛋白质、脂类和糖类合成的基地。滑面内质网还具有解毒功能，如肝细胞中的滑面内质网中含有一些酶，用以清除脂溶性的废物和代谢产生的有害物质。在正常或病理状态下，内质网在外界因素的刺激下产生内质网应激，与癌症、艾滋海默症、帕金森症等重大疾病的产生密切相关。作为一种生物体内普遍存在的还原性硫醇，半胱氨酸可以在内质网应激过程中作为一种重要的调节剂，通过与活性氧的相互作用，维持内质网中的氧化还原态。另一方面，过量的半胱氨酸可导致高高半胱氨酸的异常代谢、酸碱失衡和氧化应激，对生物体系具有很大的毒副作用。过量的半胱氨酸可诱导内质网中产生大量的囊泡，促进CHOP蛋白的表达，进而激活内质网应激。因此，实时检测内质网中半胱氨酸的含量对于深入探讨半胱氨酸在内质网的生物机制具有重要意义，有助于从细胞水平上研究内质网应激的生理和病理过程。相比于传统的电化学方法，荧光成像分析法具有灵敏度高、选择性好、响应迅速、操作简单等优点，并且对生物样品基本没有损伤，已广泛用于各种生物体内的小分子检测。因此开发新的具有高选择性、高灵敏度、光稳定性及透膜性好，能够实时快速检测细胞内质网中半胱氨酸的荧光探针具有重要的意义。相比于增强型荧光探针，比值型荧光探针不受探针环境、激光强度等外界因素的影响，更易于取得准确测试结果。目前为止，内质网靶向的比值型半胱氨酸荧光探针未见报道。
技术实现思路
针对现有技术中存在的问题，本专利技术提供一种检测细胞内质网半胱氨酸的比值型荧光探针。本专利技术的另一目的是提供一种上述荧光探针的合成方法，原料易得、合成步骤简单、收率高。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案。一种检测细胞内质网半胱氨酸的比值型荧光探针，结构式如式（I）所示：式（I）。一种上述比值型荧光探针的合成方法，包括以下步骤：（1）化合物1与N-羟基邻苯二甲酰亚胺于K2CO3的DMSO溶液中加热反应，分离、提纯得化合物2：；（2）化合物2、丙烯酰氯和N,N-二异丙基乙胺于CH2Cl2中反应，分离、提纯得淡黄色固体，即检测细胞内质网半胱氨酸的比值型荧光探针：。步骤（1）中，所述化合物1、N-羟基邻苯二甲酰亚胺、K2CO3的物质的量比为0.25:0.3:0.38。步骤（1）中，所述加热温度为120℃，反应时间为5h。步骤（1）中分离提纯步骤为，将反应液倒入冷水中，用HClO4调PH至沉淀析出，抽滤后在真空下减压浓缩，用柱层析纯化；洗脱液为体积比为20:1的CH2Cl2和CH3OH的混合。步骤（2）中，所述化合物2、丙烯酰氯、N,N-二异丙基乙胺的物质的量比为0.1:0.3:0.1。步骤（2）中，所述反应时间为2.5h。步骤（2）中，所述分离提纯步骤为将反应液于真空下减压浓缩后，用柱层析纯化；洗脱液为为50:1的CH2Cl2和CH3OH的混合。一种上述比值型荧光探针在检测细胞内质网半胱氨酸的应用。所述应用中，激发波长为390nm，检测波长为440nm和550nm。所述应用中，在半胱氨酸浓度10-80μM之间时，半胱氨酸含量与荧光强度比值I550/I440线性相关。本专利技术的作用机理：本专利技术所述的荧光探针可应用于细胞内质网半胱氨酸的检测评价。该探针作为内质网半胱氨酸的特异性探针，在半胱氨酸存在的环境下，可以将丙烯酸酯水解为羟基，生成具有高荧光发射能力的荧光物质，此时荧光探针可以发射萘酰亚胺衍生物染料的绿荧光（峰值约为550nm）。可采用荧光检测器实现产物的快速灵敏检测，检测条件为：激发波长为390nm，在400~700nm之间进行荧光发射光谱的检测。通过检测响应前和响应后的荧光强度比值来测定半胱氨酸浓度。本专利技术的有益效果为：本专利技术所述的检测内质网半胱氨酸的荧光探针具有高特异性，在进行相应半胱氨酸检测过程中基本不受其他组分的干扰；灵敏度高，具有良好的荧光发射光谱特性，可用于活细胞内质网中的半胱氨酸的实时测定。本专利技术的荧光探针可经化学合成获得，合成工艺简单易行，原料廉价易得，制备成本低，易于推广。附图说明图1是化合物2的1HNMR图谱；图2是荧光探针的1HNMR图谱；图3是荧光探针在不同浓度半胱氨酸条件下的荧光光谱；图4是荧光探针与半胱氨酸浓度的线性关系数据；图5是荧光探针与不同物质反应后的荧光光谱；图6是荧光探针在活细胞中的成像应用。具体实施方式下面结合实施例和附图对本专利技术做进一步说明，但本专利技术不受下述实施例的限制。实施例1半胱氨酸荧光探针的制备将化合物1（118mg，0.25mmol），N-羟基邻苯二甲酰亚胺（49mg，0.3mmol），K2CO3（52mg，0.38mmol）溶于4mLDMSO中，于120℃下加热回流搅拌5h，将反应混合液倒入5mL冷水中，用HClO4调PH至沉淀析出，抽滤后在真空下减压浓缩，并用CH2Cl2:MeOH=20:1的洗脱液通过柱层析纯化，得到黄色固体，为化合物2，产率56%。化合物2的1HNMR图谱见图1：；将化合物2（41mg，0.1mmol），丙烯酰氯（27mg，0.3mmol），N,N-二异丙基乙胺（DIEA，13mg，0.1mmol）溶于3mLCH2Cl2中，于室温下搅拌反应2.5h，在真空下减压浓缩后，并用CH2Cl2:MeOH=50:1的洗脱液通过柱层析纯化，得淡黄色固体，为检测内质网半胱氨酸荧光探针，产率78%。荧光探针的1HNMR图谱见图2：。实施例2荧光探针在不同半胱氨酸浓度下的荧光光谱预先准备10份5mL的5μM实施例1所得探针的PBS缓冲溶液，含5%乙醇，所加入半胱氨酸溶液至浓度为0、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200μM。然后进行荧光检测（λEx=390nm），通过分析440nm和550nm处的荧光强度比值（I550/I440）与半胱氨酸浓度的关系，评估该探针对半胱氨酸的响应性能。以半胱氨酸浓度为横坐标，以荧光强度比值（I550/I440）为纵坐标，分别做图3和图4。由图3可知，随着半胱氨酸浓度的增大，溶液的荧光强度比值（I550/I440）逐渐增强。由图4可知，当半胱氨酸浓度在10-80μM范围内，溶液的荧光强度比值（I550/I440）和半胱氨酸的浓度呈较好的线性关系。实施例3荧光探针的特异性预先准备10份5mL的5μM实施例1所得荧光探针的PBS缓冲溶液（含5%乙醇，pH=7.4），然后分别向该体系中依次加入50μL浓度为200μM的Hcys、Na2S、Na2SO3、NO、H2O2、HClO4、Cys、GSH、NaNO2、VC的PBS溶液（pH=7.4）。然后进行荧光检测（λEx=390nm），并计算各体系中荧光强度比值（I550/I440），评估不同物质对荧光探针的干扰性，结果如图5。由图5可知，当然探针溶液中加入Hcys、Na2S、Na2SO3、NO、H2O2、HClO4、GSH、NaNO2、Vc时，只有半胱氨酸可以导致溶液产生显著的荧光变本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测细胞内质网半胱氨酸的比值型荧光探针，结构式如式（I）所示：

【技术特征摘要】
1.一种检测细胞内质网半胱氨酸的比值型荧光探针，结构式如式（I）所示：式（I）。2.一种如权利要求1所述的比值型荧光探针的合成方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）化合物1与N-羟基邻苯二甲酰亚胺于K2CO3的DMSO溶液中加热反应，分离、提纯得化合物2：；（2）化合物2、丙烯酰氯和N,N-二异丙基乙胺于CH2Cl2中反应，分离、提纯得淡黄色固体，即检测内质网半胱氨酸荧光探针：。3.根据权利要求2所述的合成方法，其特征在于，步骤（1）中，所述化合物1、N-羟基邻苯二甲酰亚胺、K2CO3的物质的量比为0.25:0.3:0.38；步骤（2）中，所述化合物2、丙烯酰氯、N,N-二异丙基乙胺的物质的量比为0.1:0.3:0.1。4.根据权利要求2所述的合成方法，其特征在于，步骤（1）中，所述加热温度为120℃，反应时间为5h；...

【专利技术属性】
技术研发人员：林伟英，董宝利，卢雅如，宋文辉，张楠，
申请(专利权)人：济南大学，
类型：发明
国别省市：山东,37