一类带对硝基酚显色团的氨基酸、制备方法及应用技术

技术编号:20929309 阅读:33 留言:0更新日期:2019-04-20 12:34
一类带对硝基酚显色团氨基酸、制备方法及应用,结构带对硝基酚显色团的氨基酸,含对硝基苯酚或4‑硝基‑1‑萘酚显色团、脂肪族伯胺、脂肪族羧基;所述氨基酸,通过饱和碳原子连接到显色团;当所述显色团为对硝基苯酚时,氨基酸连在酚羟基的邻位或间位;当所述显色团为4‑硝基‑1‑萘酚时,氨基酸连在另一个不含对硝基酚芳香环的α或β位;所述氨基酸,含有至少一个伯氨基和一个羧基,还含有另一个用于与显色团上饱和碳原子相连、来自硫醇的硫原子或脂肪族伯胺的N原子;所述氨基酸,具体包括半胱氨酸、赖氨酸、瓜氨酸类天然氨基酸,及不含芳香环、分子量不超过300 Dalton、不含不饱和键、含有至少一个脂肪族伯胺、一个脂肪族羧基及与芳香环上饱和碳原子相连所需杂原子的非天然氨基酸。所述氨基酸用于测定微纳米材料表面能与小分子显色探针共价反应活泼基团量、可逆结合活性分子量。

A Kind of Amino Acids with p-Nitrophenol Chromophores, Their Preparation and Application

A class of amino acids with p-nitrophenol chromophore, preparation method and application, structure with p-nitrophenol chromophore, containing p-nitrophenol or 4-nitro-1-naphthol chromophore, aliphatic primary amine and aliphatic carboxyl group; the amino acids are connected to the chromophore through saturated carbon atoms; when the chromophore is p-nitrophenol, the amino acids are connected to the o-or meta-position of phenolic hydroxyl group. When the chromophore is 4 nitro 1 naphthol, the amino acid is connected to another alpha or beta position without the aromatic ring of p-nitrophenol; the amino acid contains at least one primary amino acid and one carboxyl group, as well as another N atom used to connect with the saturated carbon atom on the chromophore, thiol or aliphatic primary amine; the amino acid includes cysteine, lysine in particular. Natural amino acids of amino acid and citrulline, and non-natural amino acids without aromatic rings, molecular weight not exceeding 300 Dalton, unsaturated bonds, at least one aliphatic primary amine, one aliphatic carboxyl group and heteroatoms needed to connect saturated carbon atoms on aromatic rings. The amino acid is used to determine the amount of covalent reactive active groups and reversibly binding active molecular weight of the surface energy of micro-nano materials with small molecule color probe.

【技术实现步骤摘要】
一类带对硝基酚显色团的氨基酸、制备方法及应用
本专利技术属于生物
,涉及定量测定微纳米材料表面高反应活泼基团、生物活性分子的含量所需显色探针、制备及其应用,是对应微纳米材料产品质量控制及指导制备工艺优化的关键技术。
技术介绍
不溶微纳米材料表面的活泼基团,包括羟基、氨基、羧基、醛基、对甲苯磺酸酯等活性基团,其可用含量决定对应微纳米材料的应用性能,其可用含量的测定目前在全世界都是一个难题。现有方法测定此类基团过程繁琐,精度低,尤其现在可用探针多数为荧光探针,其测量灵敏度高但探针稳定性低,用于对此类微纳米材料作为生物技术产品的质量控制显然不适合。例如,表面带羧基的微米磁珠是重要的生物技术产品,但其表面羧基含量的测定很难,尤其对其产品质控一直是技术难题。生物素-链亲和素是目前应用最广的工具试剂系统。微纳米材料和链亲和素的加合物,如链亲和素磁珠,是重要的生物材料和生物技术产品。此类生物技术产品表面所含活性链亲和素的含量,决定其应用性能及应用价值,但固定化链亲和素活性蛋白含量测定也一直是技术难题。已报道连接酶、荧光团、发光基团的生物素衍生物为固定化链亲和素的测定探针,但其用于测量过程耗时,尤其所用探针稳定性差,对固定化链亲和素作为生物技术产品的生产质量控制不适合。显色探针浓度易于据其消光系数和吸收进行标定并定量,尤其此类显色探针稳定性好,在避光条件下能长期保存;将显色基团衍生成对应的水溶性可反应探针、能与固定化蛋白等结合的可逆探针,适合用于链亲和素磁珠等生物技术产品的质量控制。设计所需小分子显色探针,并转变成生物素衍生物用于测定固定化链亲和素活性蛋白量,是本专利技术创新点的具体化和解决问题创造性所在。这类显色探针的测量灵敏度低于荧光探针及酶标记探针,但稳定性好,适合固定化链亲和素产品质量控制。微纳米材料应用时主要在水性缓冲液体系。所以,所用质控显色探针必须要求水溶性;本专利技术用羧基或磺酸增溶。为尽可能提高测量灵敏度,显色探针中的显色团的消光系数应尽量高;此类显色团要易于连接所需的反应活性基团、所需配体。综合考虑,本专利技术选用对硝基苯酚、4-硝基-1-萘酚为所需显色团,其稳定性好,并易于衍生化成水溶性较好的氨基酸,而此类氨基酸中的氨基具有高反应活性,适合连接生物素类配体或与微纳米材料表面的活泼酯反应。本专利技术所述对应显色探针的制备方法为基本思路,用其他类似方法也能获得相同的显色团及可反应基团;在应用中,对应的显色团也可衍生成带有其他配体、官能团的显色探针,基于显色测定重现性优势对微纳米材料进行质控。所以,本专利技术提出作为显色探针的带对硝基酚显色团的氨基酸结构特征、制备路线、应用特征。
技术实现思路
作为制备所述显色探针所需的一类带对硝基酚显色团的氨基酸,其结构特征如下:带对硝基酚显色团的氨基酸,含对硝基苯酚或4-硝基-1-萘酚显色团、脂肪族伯胺、脂肪族羧基;进一步,所述氨基酸通过饱和碳原子连接到显色团;显色团为对硝基苯酚时,氨基酸连在酚羟基的邻位或间位;显色团为4-硝基-1-萘酚时,氨基酸连在另一个不含对硝基酚芳香环的α或β位;进一步,所述氨基酸,含有至少一个伯氨基和一个羧基,还含有另一个用于与显色团上饱和碳原子相连、来自硫醇的硫原子或脂肪族伯胺的N原子;所述氨基酸,具体包括半胱氨酸、赖氨酸、瓜氨酸类天然氨基酸,及不含芳香环、分子量不超过300Dalton、不含不饱和键、含有至少一个脂肪族伯胺、一个脂肪族羧基及与芳香环上饱和碳原子相连所需杂原子的非天然氨基酸;进一步,所述带对硝基酚显色团的氨基酸,代表结构如下;其中,1a到1f系列含4-硝基-1-萘酚显色团,2a到2f系列含4-硝基苯酚显色团。一类带对硝基酚显色团的氨基酸,其制备特征如下:用4-硝基苯酚或4-硝基-1-萘酚为起始物,与丁二酸酐、戊二酸酐通过傅氏酰基化反应获得对应的芳香酮酸;用NaBH4或类似物将与芳香环相连羰基选择性还原为饱和醇,再将该羟基转变成溴代烃或生成对甲苯磺酸酯,然后与巯基乙胺、半胱氨酸、赖氨酸、鸟氨酸类天然氨基酸,及不含芳香环、分子量不超过300Dalton、不含不饱和键、含有至少一个脂肪族伯胺、一个脂肪族羧基及与芳香环上饱和碳原子相连所需杂原子酸的非天然氨基酸反应,得到所述带显色团的氨基酸;进一步,用任一个位置含羟甲基的4-硝基苯酚或4-硝基-1-萘酚为起始物,直接将羟甲基转变成对应的溴代烃、对甲苯磺酸酯,然后与半胱氨酸、赖氨酸、鸟氨酸类天然氨基酸,及不含芳香环、分子量不超过300Dalton、不含不饱和键、含有至少一个脂肪族伯胺、一个脂肪族羧基及与芳香环上饱和碳原子相连所需杂原子酸的非天然氨基酸反应,得到所述带显色团的氨基酸。一类带对硝基酚显色团的氨基酸,直接或间接作为显色探针,应用特征在于:所述带对硝基酚显色团的氨基酸或其衍生物作为小分子显色探针,用于测定微纳米材料表面能与小分子显色探针共价反应活泼基团量、可逆结合活性分子量;应用时,先以过量小分子显色探针与含有对应活泼基团、活性分子的微纳米材料在最适条件下反应,分离去微纳米材料及所结合小分子显色探针,将上清液调pH>8.0,测定剩余显色探针中对硝基苯酚显色团在390~420nm间某波长下吸收、4-硝基-1-萘酚显色团在430~490nm间某波长下吸收,推算结合显色探针量,按所用小分子显色探针与微纳米材料表面活泼基团、活性分子反应摩尔比,换算成微纳米材料表面的活泼基团、活性分子量;进一步,所述带对硝基酚显色团的氨基酸或其衍生物作为小分子显色探针,代表如下:(a)直接作为显色探针,通过与其脂肪族伯胺反应,测定微纳米材料表面羧基活泼酯、对甲苯磺酸酯;(b)所述带对硝基酚显色团的氨基酸,与生物素活泼酯反应生成生物素酰胺,作为光度法测定固定化链亲和素量的小分子显色探针,如用于测定链亲和素磁珠上固定化链亲和素的含量;(c)所述带对硝基酚显色团的氨基酸,与巯基被乙酰基保护的巯基乙酸活泼酯反应,脱乙酰基保护得含脂肪族硫醇的显色探针,用于测定微纳米材料表面可与巯基反应的活泼基团的含量,包括与巯基反应的卤代乙酰胺、环氧基、卤代苄基、醛基(d)将权利要求1所述带对硝基酚显色团的氨基酸1a、1b、2c及2d中巯基乙胺基团换成巯基乙磺酸或巯基丙磺酸,得到对应的四种新显色团3a、3b、3c及3d,相当于在权利要求2所述制备方法特征(1)中使用巯基乙胺时换成巯基乙磺酸或巯基丙磺酸;将所得不含氨基的新显色探针的羧基活化成NHS的活泼酯,用于测定微纳米材料表面的脂肪族伯仲氨基的含量。附图说明图1.所述带对硝基酚显色团的氨基酸直接为显色探针,测定磁珠表面活泼酯量的响应曲线图2.所述氨基酸用生物素修饰为探针,用于显色测定链亲和素磁珠MSP-SAV-F1量的响应曲线。具体实施方式实施例中所用试剂及溶液如下:小分子氨基化显色探针探针结合缓冲液和洗涤缓冲液:pH6.0,25mMMES小分子生物素化显色探针探针结合缓冲液和洗涤缓冲液:pH7.4,20mMPBS链亲和素磁珠MSP-SAV-F1:详见http://www.fbdbio.com/html/fwzx/wjxz/。实施例1将5g2-羟基-5-硝基苄醇加入250ml三口烧瓶中,加入10010%硫酸及10gKBr,60度反应6小时;旋转蒸发仪真空抽干,收集得到2-羟基本文档来自技高网
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【技术保护点】
1.一类带对硝基酚显色团的氨基酸,其结构特征如下:(1) 带对硝基酚显色团的氨基酸,含对硝基苯酚或4‑硝基‑1‑萘酚显色团、脂肪族伯胺、脂肪族羧基;(2) 所述氨基酸,通过饱和碳原子连接到显色团;当所述显色团为对硝基苯酚时,氨基酸连在酚羟基的邻位或间位;当所述显色团为4‑硝基‑1‑萘酚时,氨基酸连在另一个不含对硝基酚芳香环的α或β位;(3) 所述氨基酸,含有至少一个伯氨基和一个羧基,还含有另一个用于与显色团上饱和碳原子相连、来自硫醇的硫原子或脂肪族伯胺的N原子;所述氨基酸,具体包括半胱氨酸、赖氨酸、瓜氨酸类天然氨基酸,及不含芳香环、分子量不超过300 Dalton、不含不饱和键、含有至少一个脂肪族伯胺、一个脂肪族羧基及与芳香环上饱和碳原子相连所需杂原子的非天然氨基酸;(4) 所述带对硝基酚显色团的氨基酸,代表结构如下;其中,1a到1f系列含4‑硝基‑1‑萘酚显色团,2a到2f系列含4‑硝基苯酚显色团。

【技术特征摘要】
1.一类带对硝基酚显色团的氨基酸,其结构特征如下:(1)带对硝基酚显色团的氨基酸,含对硝基苯酚或4-硝基-1-萘酚显色团、脂肪族伯胺、脂肪族羧基;(2)所述氨基酸,通过饱和碳原子连接到显色团;当所述显色团为对硝基苯酚时,氨基酸连在酚羟基的邻位或间位;当所述显色团为4-硝基-1-萘酚时,氨基酸连在另一个不含对硝基酚芳香环的α或β位;(3)所述氨基酸,含有至少一个伯氨基和一个羧基,还含有另一个用于与显色团上饱和碳原子相连、来自硫醇的硫原子或脂肪族伯胺的N原子;所述氨基酸,具体包括半胱氨酸、赖氨酸、瓜氨酸类天然氨基酸,及不含芳香环、分子量不超过300Dalton、不含不饱和键、含有至少一个脂肪族伯胺、一个脂肪族羧基及与芳香环上饱和碳原子相连所需杂原子的非天然氨基酸;(4)所述带对硝基酚显色团的氨基酸,代表结构如下;其中,1a到1f系列含4-硝基-1-萘酚显色团,2a到2f系列含4-硝基苯酚显色团。2.一类带对硝基酚显色团的氨基酸,制备方法特征如下:(1)用4-硝基苯酚或4-硝基-1-萘酚为起始物,与丁二酸酐或戊二酸酐通过傅氏酰基化反应获得对应的芳香酮酸;用NaBH4或类似物将与芳香环相连羰基选择性还原为饱和醇,再将羟基转变成溴代烃或生成对甲苯磺酸酯,然后与巯基乙胺、半胱氨酸、赖氨酸、鸟氨酸类天然氨基酸,及不含芳香环、分子量不超过300Dalton、不含不饱和键、含有至少一个脂肪族伯胺、一个脂肪族羧基及与芳香环上饱和碳原子相连所需杂原子酸的非天然氨基酸反应,得到带对硝基酚显色团的氨基酸;(2)用任一个位置含羟甲基的4-硝基苯酚或4-硝基-1-萘酚为起始物,直接将羟甲基转变成对应的溴代烃、对甲苯磺酸酯,然后与半胱氨酸、赖氨酸、鸟氨酸类天然氨基酸,及不含芳香环、分子量不超过300Dalton、不含不饱和键、含有至少一个脂肪族伯胺、一个脂肪族羧基及与芳...

【专利技术属性】
技术研发人员:廖飞龙高波谢万军
申请(专利权)人:重庆博蓝鹰生物技术有限公司
类型:发明
国别省市:重庆,50

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