一种肝损伤内质网应激差异性表达模型小鼠的建立及检测方法技术

本发明专利技术提供了一种肝损伤内质网应激差异性表达模型小鼠的建立及检测方法，属于动物模型技术领域。将性别、生长周龄和体重相同的BALB/c小鼠分2组，急性组给药一次，慢性组每周给药两次，两次给药的间隔为72h，连续给药12～16周；给药后处死2组小鼠，分别提取两组小鼠的肝组织；分别测定小鼠肝组织中GRP78和CHOP表达水平，计算两组CHOP/GRP78的比值；当慢性组CHOP/GRP78比值显著高于急性组，慢性组小鼠为肝损伤内质网应激差异性表达模型小鼠。本发明专利技术为研究急性和慢性肝损伤及病情进展的发病机制提供原料，为临床肝病的预防、治疗提供理论基础，具有方法简便、建模成功率高、可重复性好的优点。

Establishment and Detection of a Differential Expression Model of Endoplasmic Reticulum Stress in Mice with Liver Injury

The invention provides the establishment and detection method of a liver injury endoplasmic reticulum stress differential expression model mouse, which belongs to the technical field of animal models. BALB/c mice of the same sex, growth age and weight were divided into two groups, the acute group was given once, the chronic group was given twice a week, the interval between two doses was 72 hours, and the administration lasted 12-16 weeks. After administration, the mice of the two groups were sacrificed and the liver tissues of the two groups were extracted. The expression levels of GRP78 and CHOP/GRP78 in the liver tissues of mice were determined, and the ratio of CHOP/G/GRP78 in the chronic group was calculated. The ratio of RP78 was significantly higher in chronic group than that in acute group. Rats in chronic group were differentially expressed endoplasmic reticulum stress model mice with liver injury. The invention provides raw materials for studying the pathogenesis of acute and chronic liver injury and disease progression, provides theoretical basis for the prevention and treatment of clinical liver disease, and has the advantages of simple method, high success rate of modeling and good repeatability.

【技术实现步骤摘要】
一种肝损伤内质网应激差异性表达模型小鼠的建立及检测方法
本专利技术属于动物模型构建
，具体涉及一种肝损伤内质网应激差异性表达模型小鼠的建立及检测方法。
技术介绍
肝损伤是由多种病因所致的以短时间内大量肝细胞变性、坏死和炎细胞浸润等为特征的肝功能损伤的临床综合征，死亡率高。而肝细胞坏死是各型肝损伤共同的病理特点，包括：肝细胞坏死(necrosis)、程序性坏死(necroptosis)、凋亡(apoptosis)及自噬(autophagyd)。肝病病情进展，即肝细胞损伤与多种因素有关，在各种致病因素作用下，肝细胞通过启动多种保护机制维持细胞内环境稳定，促进细胞存活。故肝细胞自身的抗损伤能力与损伤因素共同决定肝病的结局。绝大多数肝损伤患者优先选择的治疗方法为内科综合治疗，然而，由于发病机制尚不清楚，内科治疗效果局限，其死亡率为50～80％。实验动物肝损伤内质网应激差异性表达模型是研究各种肝脏疾病的发病机制及治疗药物筛选中必不可缺的一个工具。近年来国内外制造实验性肝损伤动物模型方法主要集中在化学性肝损伤模型和免疫性肝损伤模型。免疫性肝损伤模型多采用刀豆蛋白A(Con)、脂多糖(BCG+LPS)等造模；化学性肝损伤模型主要是由四氯化碳(CCl4)、D-氨基半乳糖(D-Gal)、乙醇、致黄素等诱导。另外，现有技术中公开了一种新型的造模方法，例如公开号CN103735561A的专利公开了采用衣霉素二甲基亚砜溶液作为内质网应激诱导剂给小鼠灌胃，给药8～48h后完成动物模型的建立，所述方法虽然能了解细胞在应激状态下的自我调控能力，还能进一步了解肝病发病机制，从而对制定新的干预、治疗措施具有较高的帮助。但是该方法并未给出采用上述给药方法处理的小鼠是否真正形成小鼠肝损伤模型，采用的是测定给药小鼠肝脏中AST和ALT的酶活力，测定肝重和肝脏指数以及做病理切片，可见上述方案虽然公开了肝损伤小鼠模型的建立方法，但是其后续验证步骤较复杂，测定内容较大，而且测定结果的判断方法没有给出明确的判断标准，对于没有经验的研究者来说判断困难。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种新型的肝损伤内质网应激差异性表达模型小鼠的建立及检测方法，所述方法不仅操作简便、对操作者要求低，而且建模成功率高。本专利技术提供的一种肝损伤内质网应激差异性表达模型小鼠的建立及检测方法，包括以下步骤：1)随机选取相同性别、相似生长周龄和体重的BALB/c小鼠分为2组，根据给药方法分为急性组或慢性组；急性组给药一次，给药24h后处死小鼠；慢性组每周给药两次，两次给药的间隔时间为72h，连续给药12～16周后处死小鼠；给药的药物为内质网应激诱导剂；2)分别提取步骤1)中两组小鼠的肝组织，得到急性组小鼠肝组织和慢性组小鼠肝组织；3)分别测定所述急性组小鼠肝组织和慢性组小鼠肝组织中GRP78和CHOP的表达水平，计算急性组CHOP/GRP78的比值和慢性组CHOP/GRP78的比值；4)分析急性组CHOP/GRP78比值与慢性组CHOP/GRP78的比值相比变化情况，当慢性组CHOP/GRP78比值显著高于急性组CHOP/GRP78的比值时，慢性组小鼠为肝损伤内质网应激差异性表达模型小鼠。优选的，步骤1)中内质网应激诱导剂为CCl4橄榄油混合溶液；所述CCl4橄榄油混合溶液中CCl4和橄榄油的体积比为1∶3～5。优选的，所述CCl4橄榄油混合溶液的给药量为5～10ml/Kg小鼠。优选的，步骤3)中急性组小鼠肝组织和慢性组小鼠肝组织中GRP78和CHOP的表达水平的测定方法包括采用蛋白质印迹法将GRP78或CHOP形成条带，测定GRP78或CHOP条带的灰度值，以所述CHOP和GRP78的灰度值比值表示急性组CHOP/GRP78表达水平比值和慢性组CHOP/GRP78表达水平的比值。优选的，步骤1)中BALB/c小鼠的体重包括23～27g。优选的，步骤1)中在急性组或慢性组中每组不低于8只BALB/c小鼠。本专利技术提供了一种肝损伤内质网应激差异性表达模型小鼠的建立及检测方法，根据给药时间分为急性组肝损伤和慢性组肝损伤，这是现有技术未提及的肝损伤内质网应激差异性表达的实验动物模型，然后检测GRP78和CHOP蛋白的表达为核心评估指标，其中GRP78蛋白为促生存标志蛋白，其表达预示肝损伤有所好转，而CHOP蛋白为凋亡标志蛋白，其表达预示肝损伤加重；同时设定成功建立肝损伤内质网应激差异性表达模型小鼠的判断标准为当慢性组CHOP/GRP78比值显著高于急性组CHOP/GRP78的比值时，慢性组小鼠为肝损伤内质网应激差异性表达模型小鼠。本专利技术提供的方法具有检测准确率100％的特点，为建立肝损伤内质网应激差异性表达模型小鼠提供了新思路，同时为研究急性和慢性肝损伤及病情进展的发病机制提供实验工具，为临床肝病的预防、治疗提供理论基础。同时，本专利技术提供的建立及检测方法，该具有条件要求低、方法简便、稳定性好、建模成功率高、可重复性好等优点；以Westernblot检测GRP78与CHOP的表达水平，具有操作简便、可重复性好的特点。附图说明图1为实施例中建立CCl4诱导模型小鼠内质网应激差异性表达的流程图；图2为实施例中模型组的蛋白质印迹法(Westernblot)结果图和统计图；图3为实施例中模型组中GRP78和CHOP蛋白表达量及CHOP/GRP78值的柱形图。具体实施方式本专利技术提供的一种肝损伤内质网应激差异性表达模型小鼠的建立及检测方法，包括以下步骤：1)随机选取相同性别、相似生长周龄和体重的BALB/c小鼠分为2组，根据给药方法分为急性组或慢性组；急性组的给药方法为给药次数为一次，给药24h后处死小鼠；慢性组的给药方法为每周给药两次，两次给药的间隔时间为72h，连续给药12～16周后处死小鼠；给药的药物为内质网应激诱导剂；2)分别提取步骤1)中两组小鼠的肝组织，得到急性组小鼠肝组织和慢性组小鼠肝组织；3)分别测定所述急性组小鼠肝组织和慢性组小鼠肝组织中GRP78和CHOP的表达水平，计算急性组CHOP/GRP78的比值和慢性组CHOP/GRP78的比值；4)分析急性组CHOP/GRP78比值与慢性组CHOP/GRP78的比值相比变化情况，当慢性组CHOP/GRP78比值显著高于急性组CHOP/GRP78的比值时，慢性组小鼠为肝损伤内质网应激差异性表达模型小鼠。本专利技术提供了随机选取相同性别、相似生长周龄和体重的BALB/c小鼠分为2组，根据给药方法分为急性组或慢性组；急性组的给药方法为给药次数为一次，给药后24h；慢性组的给药方法为每周给药两次，两次给药的间隔时间为72h，连续给药12～16周；给药的药物为内质网应激诱导剂。在本专利技术中，内质网应激诱导剂优选为CCl4橄榄油混合溶液；所述CCl4橄榄油混合溶液中CCl4和橄榄油的体积比优选为1∶3～5，更优选为1∶4。所述CCl4橄榄油混合溶液优选用0.22微米滤菌器滤菌。所述CCl4橄榄油混合溶液的给药量优选为5～10ml/Kg小鼠。在本专利技术中，所述给药方法优选包括以下步骤：在小鼠下腹部离腹白线约0.5cm处将注射针刺入皮下，沿皮下向前推进3～5cm，然后使针头与小鼠腹部约成30°刺入腹腔，针头刺入的速度要快，待抵抗感消失瞬本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种肝损伤内质网应激差异性表达模型小鼠的建立及检测方法，其特征在于，包括以下步骤：1)随机选取相同性别、相似生长周龄和体重的BALB/c小鼠分为2组，根据给药方法分为急性组或慢性组；急性组给药一次，给药24h后处死小鼠；慢性组每周给药两次，两次给药的间隔时间为72h，连续给药12～16周后处死小鼠；给药的药物为内质网应激诱导剂；2)分别提取步骤1)中两组小鼠的肝组织，得到急性组小鼠肝组织和慢性组小鼠肝组织；3)分别测定所述急性组小鼠肝组织和慢性组小鼠肝组织中GRP78和CHOP的表达水平，计算急性组CHOP/GRP78的比值和慢性组CHOP/GRP78的比值；4)分析急性组CHOP/GRP78比值与慢性组CHOP/GRP78的比值相比变化情况，当慢性组CHOP/GRP78比值显著高于急性组CHOP/GRP78的比值时，慢性组小鼠为肝损伤内质网应激差异性表达模型小鼠。

【技术特征摘要】
1.一种肝损伤内质网应激差异性表达模型小鼠的建立及检测方法，其特征在于，包括以下步骤：1)随机选取相同性别、相似生长周龄和体重的BALB/c小鼠分为2组，根据给药方法分为急性组或慢性组；急性组给药一次，给药24h后处死小鼠；慢性组每周给药两次，两次给药的间隔时间为72h，连续给药12～16周后处死小鼠；给药的药物为内质网应激诱导剂；2)分别提取步骤1)中两组小鼠的肝组织，得到急性组小鼠肝组织和慢性组小鼠肝组织；3)分别测定所述急性组小鼠肝组织和慢性组小鼠肝组织中GRP78和CHOP的表达水平，计算急性组CHOP/GRP78的比值和慢性组CHOP/GRP78的比值；4)分析急性组CHOP/GRP78比值与慢性组CHOP/GRP78的比值相比变化情况，当慢性组CHOP/GRP78比值显著高于急性组CHOP/GRP78的比值时，慢性组小鼠为肝损伤内质网应激差异性表达模型小鼠。2.根据权利要求1所述的建立及检测方法，其特...

【专利技术属性】
技术研发人员：何毅怀，唐永静，田仁冬，沈访，
申请(专利权)人：遵义医学院附属医院，
类型：发明
国别省市：贵州,52