DNA四面体在制备治疗角膜损伤药物中的用途制造技术

为了解决目前角膜损伤缺乏特效药的问题，本发明专利技术提供了DNA四面体在制备治疗角膜损伤药物中的用途，所述DNA四面体是由四条DNA单链通过碱基互补配对形成的四面体纳米结构。本发明专利技术可以有效促进组织再生，实现损伤角膜的愈合，且无毒副作用，制备过程简单。

Application of DNA Tetrahedron in the Preparation of Drugs for Corneal Injury

In order to solve the problem of lacking specific drugs for corneal injury, the present invention provides the application of DNA tetrahedron in the preparation of drugs for corneal injury. The DNA tetrahedron is a tetrahedron nanostructure formed by four DNA single strands through base complementary pairing. The invention can effectively promote tissue regeneration, achieve healing of injured cornea, has no toxic side effects and simple preparation process.

【技术实现步骤摘要】
DNA四面体在制备治疗角膜损伤药物中的用途
本专利技术涉及眼科药物领域，特别涉及DNA四面体在制备治疗角膜损伤药物中的用途。
技术介绍
角膜损伤是临床常见而处理棘手的眼外伤之一，以化学烧伤为主，而化学烧伤中最常见的是碱烧伤。角膜损伤后发生的无菌性角膜溃疡、穿孔、眼球粘连及继发性青光眼等更是眼部致残的常见原因。临床上角膜损伤的治疗方式包括及时彻底清洗结膜囊、结膜下注射维生素C、阿托品散瞳、局部及全身抗菌消炎、营养角膜、羊膜移植、自血疗法、遮盖患眼等，但这些药物只能轻微地缓解病情，治疗效果较差。有研究使用皮质类固醇激素治疗角膜损伤，结果显示其具有抗炎和免疫抑制作用，具有一定的治疗作用。但是皮质类固醇激素会抑制组织再生，并具有其它潜在的副作用，总体上治疗效果仍然不够。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种新的治疗角膜损伤药物。本专利技术首先提供了DNA四面体在制备治疗角膜损伤药物中的用途，所述DNA四面体是由四条DNA单链通过碱基互补配对形成的四面体纳米结构；优选地，所述损伤是碱烧伤。进一步地，所述DNA四面体是由所述四条DNA单链经90～98℃变性10～15min、2～8℃退火20～30min制备而成。进一步地，所述DNA四面体是由所述四条DNA单链经95℃变性10min、4℃退火20min制备而成。进一步地，所述DNA四面体的棱长为10-100bp。进一步地，组成所述DNA四面体的四条单链的序列如SEQIDNO.1～4所示。进一步地，所述药物是滴眼液。进一步地，所述药物的使用浓度为100～500nM。进一步地，所述药物的使用浓度为250nM。本专利技术还提供了一种治疗角膜损伤的药物，所述药物是以前述的DNA四面体为活性成分、加上药学上可接受的辅料制备而成；优选地，所述损伤是碱烧伤。进一步地，所述药物是滴眼液。专利技术人通过对角膜损伤和DNA四面体的研究，提供了一种与传统药物药理不同的药物。传统药物主要靠消炎，使得角膜自行恢复，效果较差；而本专利技术则具有促进角膜上皮细胞增殖和迁移的作用，其治疗角膜损伤的效果较好。本专利技术具有如下有益效果：1)本专利技术的DNA四面体安全无毒；2)本专利技术的DNA四面体能够促进角膜上皮细胞的增殖和迁移；3)本专利技术的DNA四面体能促进组织再生，进而促进角膜上皮愈合；4)本专利技术的DNA四面体合成方法简单。显然，根据本专利技术的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本专利技术上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。以下通过具体实施方式对本专利技术的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本专利技术上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本专利技术上述内容所实现的技术均属于本专利技术的范围。附图说明图1：DNA四面体合成的示意图。图2：DNA四面体透射电镜检测图。图3：DNA四面体动态光散射检测粒径分布图。图4：三项迁移试验；A，细胞划痕试验；B，transwell试验结晶紫染色结果；C，细胞划痕试验24h定量统计结果，D，transwell试验统计结果，E，RTCA试验结果。图5：三项增殖试验；A，CCK-8试验结果；B，RTCA试验结果；C，BrdU免疫荧光染色试验结果。图6：兔眼角膜损伤治愈效果图；A，角膜损伤后兔眼的大体观；B，临床检查的评分统计结果，7天8只兔的角膜透光度评分；C，临床检查的评分统计结果，14天4只兔的角膜透光度评分；D，临床检查的评分统计结果，7天8只兔的角膜上皮愈合率；E，临床检查的评分统计结果，14天4只兔的角膜上皮愈合率。具体实施方式实施例DNA四面体的制备与鉴定1.方法1.1DNA四面体(TDN)的制备方法TDN是由独特设计的四条DNA单链(S1，S2，S3，S4)通过一个快速、简单、特定的PCR程序(95℃维持10min，快速降温到4℃维持20min，4℃长期保存)自组装合成的。四条单链按照等摩尔比(每条单链加入1μl浓度为100μM的储存液)加入到含有96μl的TMbuffer(10mMTris-HCl，50mMMgCl2，pH8.0)的200μlEP管中，将反应液加热到95℃维持10min，然后快速降温到4℃合成了TDN。1.2四条DNA单链的具体序列如下：1.3聚丙烯酰胺凝胶电泳、动态光散射(DLS)、原子力显微镜(AFM)、透射电镜(TEM)和电荷测定对TDN进行表征：①DLS：合成出来的TDN用二次蒸馏水稀释至250nM然后在ZETAPals分析仪上进行观察。②AFM：原子力显微镜对TDN纳米颗粒的表面形貌进行表征是由轻敲扫描模式下ShimadzuSPM-9700原子力显微镜完成的。TDN用TM缓冲溶液稀释至20nM，然后将10μl的该溶液滴在新鲜的云母片上待干大约15min，然后进行观察。③TEM：透射电镜对TDN的微观结构进行观察，显示TDN纳米材料为粒径10nm的分布均匀的小颗粒。④Zetapotential：采用ZetasizerNanoZS90(MalvemInstrumentsLtd，U.K.)测定单链、TDN的电位。2.结果透射电镜视野下出现四面体结构，表明DNA四面体组装成功(图2)。动态光散射结果显示，四面体的粒径大约为10nm(图3)。从以上结果可知，TDN的合成是成功的。实验例1细胞迁移实验创面愈合是动态的、严格有序的生物学过程，再上皮化在其中起着非常重要的作用。创面的再上皮化主要依赖于上皮细胞从创缘向创面中心的迁移。为了探究TDN是否有助于人角膜上皮细胞的迁移，专利技术人实施了如下实验。1.方法划痕试验，transwell试验及RTCA法检测TDN对人角膜上皮细胞的迁移的影响。划痕试验：将细胞以1.5×105个/孔的密度接种到12孔板中进行培养，当细胞铺满80-90％后，用无菌枪尖划出两道垂直相交的划痕，清洗掉细胞碎片后，加入TDN浓度为125nM，250nM，375nM的细胞培养基者为试验组，加入不含TDN的细胞培养基者为对照组。在0h，12h，24h采集划痕关闭的图像，进行定性及半定量分析。Transwell试验：transwell膜孔径选择8μm。在24孔transwell小室的上室中接种5×104个/孔的细胞，培养基体积为250μl，培养24h后，将生长培养基替换成含1％的胎牛血清和125nM和250nMTDN的DMEM培养基，此组为实验组；对照组更换为含1％的胎牛血清和不含TDN的DMEM培养基。24小时后，PBS冲洗迁移的细胞3次，用甲醇固定20min后，结晶紫染色并采图，分析实验组和对照组中迁移细胞数目。RTCA迁移试验：在RTCA的下层孔板内加入165μl含1％的胎牛血清的培养基，上层孔板内加入相同成分培养基30μl，上下板子组合安装好后，放入细胞培养箱中静置1小时。1小时候，加入细胞悬液和TDN溶液，使细胞接种密度为5×104个/孔，TDN浓度为0nM，125nM和250nM。RTCA仪器每隔15分钟检测一次细胞迁移情况，总共检测24h，生成迁移曲线。2.结果细胞划痕试验中，可见12h和24h时，试验组细胞迁移数大于对照组，在TDN浓度为250nM组，细胞迁移最快(图4A、C)。Transwell试验中，24小时后的结晶紫染色图片显示TDN能够促进细胞迁移，且250nM时促进作用最强(图4B本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.DNA四面体在制备治疗角膜损伤药物中的用途，所述DNA四面体是由四条DNA单链通过碱基互补配对形成的四面体纳米结构；优选地，所述损伤是碱烧伤。

【技术特征摘要】
1.DNA四面体在制备治疗角膜损伤药物中的用途，所述DNA四面体是由四条DNA单链通过碱基互补配对形成的四面体纳米结构；优选地，所述损伤是碱烧伤。2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述DNA四面体是由所述四条DNA单链经90～98℃变性10～15min、2～8℃退火20～30min制备而成。3.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述DNA四面体是由所述四条DNA单链经95℃变性10min、4℃退火20min制备而成。4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述DNA四面体的棱长为10-100bp。5.如权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：林云锋，刘楠馨，张晓琳，
申请(专利权)人：四川大学，
类型：发明
国别省市：四川,51