本发明专利技术公开一种芸香苷抑制小鼠黑色素瘤细胞增殖并诱导其细胞凋亡的应用，包括：作用于小鼠B16‑F10黑色素瘤细胞的芸香苷工作液的配制方法以及对细胞增殖抑制与凋亡诱导的药物处理方法；芸香苷工作液的配制方法及作用浓度：1％NaOH溶解芸香苷，DEME完全培养基定容、稀释配制成1.64、1、0.5、0.25、0.125、0.0625mM各浓度瘤细胞培养药物工作液，并对1mM药物浓度作用培养后的瘤细胞进行活性和凋亡检测，发现芸香苷促凋亡效果好、细胞毒性小，本发明专利技术开发了一种基于芸香苷的抗黑色素瘤单体药物，具有良好的应用前景。
Application of Rutin in Inhibiting Proliferation and Inducing Apoptosis of Mouse Melanoma Cells
The invention discloses an application of Rutin in inhibiting the proliferation of mouse melanoma cells and inducing their apoptosis, including: the preparation method of rutin working fluid acting on mouse B16 F10 melanoma cells and the drug treatment method for inhibiting cell proliferation and inducing apoptosis; the preparation method and the concentration of rutin working fluid: 1% NaOH dissolves rutin, and DEME fully cultures. The drug working fluid of 1.64, 1, 0.5, 0.25, 0.125 and 0.0625 mM was prepared by dilution and dilution. The activity and apoptosis of the tumor cells cultured with 1 mM drug concentration were detected. It was found that rutin had good apoptotic effect and little cytotoxicity. The present invention developed an anti-melanoma monomer drug based on rutin, which has good application prospect.
【技术实现步骤摘要】
一种芸香苷抑制小鼠黑色素瘤细胞增殖并诱导其细胞凋亡的应用
本专利技术属于医药领域，具体涉及一种芸香苷抑制小鼠黑色素瘤细胞增殖并诱导其细胞凋亡的应用。
技术介绍
黑素瘤是源于表皮正常黑色素细胞或原有痣细胞的一种恶性肿瘤，恶性程度高，是皮肤癌致死的主要肿瘤(75％)，且其发病率依然呈逐年上升趋势。酪氨酸酶(EC1.14.18.1，Tyrosinase)是黑色素合成的关键酶，是调控生物合成黑色素的限速酶，与黑素瘤的发生直接相关。芸香苷又称为维生素P或槲皮素-3-O-芸香糖苷，属黄酮类物质，其分子式为C27H30O16，分子量为610.5，分子结构式：大多数的中草药中都含有芸香苷，如益母草、芦荟、枸杞等。在木本植物中，特别是槐树的树皮和槐花的花蕾中，具有较高含量。芸香苷具有多种功效，其中以维生素P样的功效最为显著，能够减弱毛细血管的通透性和脆性，起到软化血管的作用；同时有利于细胞的生长和防止血细胞凝聚沉积堵塞血管。此外，大量研究表明，芸香苷还具有抗炎、抗氧化、抗过敏、抗菌、抗病毒、抗肿瘤、抗心律失常、降低血清胆固醇、增强免疫力、抑制醛糖还原酶等作用。因此，结合芸香苷抗肿瘤药学活性、对细胞黑色素生成具有抑制作用和细胞毒性小的优点，开发其作为一种抗黑色素瘤药物具有较大前景。
技术实现思路
针对上述技术问题，本专利技术提供一种芸香苷抑制小鼠黑色素瘤细胞增殖并诱导细胞发生凋亡的应用，开发了一种基于芸香苷的抗黑色素瘤药物，提供了一种抗性效果好、细胞毒性小的抗肿瘤药物。本专利技术的技术方案如下：公开了一种芸香苷抑制小鼠B16-F10黑色素瘤细胞增殖并诱导其细胞凋亡的应用，包括：作用于小鼠B16-F10黑色素瘤细胞的芸香苷工作液的配制与对该细胞增殖抑制、凋亡诱导的药物处理方法，以及对药物处理后瘤细胞增殖和凋亡的效果分析。本专利技术的有益效果是：通过本专利技术公开了一种将芸香苷应用于小鼠B16-F10黑色素瘤细胞增殖的抑制并诱导细胞凋亡的应用，实验证实芸香苷对小鼠黑色素瘤细胞的增殖抑制效果好、对正常皮肤角质细胞毒性小，开发了一种基于芸香苷的抗肿瘤药物，具备良好的应用前景。附图说明图1是本专利技术制备的芸香苷抑制小鼠黑色素瘤细胞增殖的细胞MTT检测图；图2为芸香苷对HaCaT细胞的细胞毒性检测图；图3、图4、图5和图6分别是本专利技术制备的芸香苷抑制小鼠黑色素瘤细胞增殖的细胞周期分析的细胞DAPI染色结果图；其中：图3和图4分别是MD高内涵检测不同时期细胞数量的结果，图3为空白对照组，图4为1mM芸香苷处理组；图5和图6分别是MD高内涵检测不同时期DNA含量的结果；图5为空白对照组，图6为1mM芸香苷处理组。具体实施方式下面结合附图对本专利技术作进一步的详细说明，以使本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。本专利技术公开一种芸香苷抑制小鼠黑色素瘤细胞增殖并诱导细胞凋亡的应用，包括：芸香苷工作液的配制；瘤细胞的培养与药物作用；细胞MTT检测；细胞周期分析；细胞凋亡分析。芸香苷工作液的配制：称取0.03g芸香苷标准品用3.5mL1％NaOH溶解，再用DEME完全培养基定容至30mL，配成1.64mM的芸香苷溶液；用0.22μm针筒细菌滤器过滤；使用时用完全培养基依次稀释配制成1、0.5、0.25、0.125、0.0625mM5个浓度；瘤细胞的培养与药物作用；将小鼠B16细胞株用含有10％胎牛血清的DEME完全培养基在37℃、体积分数为5％CO2、完全饱和湿度条件下常规培养，48h更换培养基，细胞生长达饱和状态时，用0.25％胰蛋白酶消化传代，2天传代1次，实验选用对数生长期细胞；正常培养细胞弃培养基后用2mLPBS清洗，加入2mL胰酶消化约90s，至细胞基本变圆，继续加入4mL终止液(含10％血清的DMEM培养基)终止消化，完全转移至15mL离心管中，吹打混匀细胞后取200μL细胞悬液在血细胞计数板上进行计数；离心(离心条件：室温25℃，1000rpm，10min)收集细胞；离心后弃上清液，根据接种量和计数结果加入适当体积的培养基悬浮混匀细胞接种到培养板中，补足培养基，于培养箱中进行培养，接种至细胞贴壁后更换含不同浓度药物的培养基培养。不同培养板细胞接种量如下表所示：细胞MTT检测；调整B16细胞株细胞悬液浓度为1.2×104/孔，加入96孔培养板内，每孔200μL，置37℃、5V％的CO2孵箱培养24h。弃原培养基，分别加入含芸香苷(1.64mM、1mM、0.5mM、0.25mM、0.125mM、0.0625mM)的10％胎牛血清DEME培养基，并设空白对照组和调零组，每组均设5个复孔，继续培养48h。于结束前4h，加入MTT溶液(5mg/mL)20μL/孔，4h后吸出上清液，加入50μLDMSO溶液，振荡10min，使结晶充分溶解。在570nm处用酶标仪检测各孔的吸光值。计算细胞增殖抑制率。实验重复3遍以上，结果如图1所示。随着芸香苷浓度的增加，黑色素瘤细胞活性逐渐降低，当芸香苷浓度为1.64mM时，细胞活性下降至24.6％。细胞周期分析细胞DAPI染色：(1)细胞用PBS漂洗一遍后，用4％多聚甲醛PBS室温下固定15min。(2)用PBS在室温下漂洗三次，每次10min(每次最低不少于2min)。(3)用含有0.5％Trition-X-100的PBS在室温下穿孔15min。(4)用PBS在室温下漂洗2次，每次10min。(5)加入DAPI染色液室温下作用15min以上(用锡箔纸包裹避光)。(6)用PBS在室温下漂洗2次，每次10分钟。然后用MD高内涵分析仪进行分析，所得结果说明芸香苷可阻断黑色素瘤细胞由G1期向S期转化的进程，造成G1期细胞堆积，并在一段时间之后，使细胞丧失增殖能力，从而抑制黑色素瘤细胞的增殖。实验结果分别如图3、图4、图5、图6所示。细胞凋亡分析Hoechst染色分析：细胞接种贴壁后更换含1mM芸香苷的完全培养基培养48h后取出24孔培养板，PBS清洗后加入100μLHoechst33324染液，37℃避光染色30min。染色结束后，用PBS清洗3遍。取出培养板中的盖玻片，在细胞生长面滴加25μL抗荧光淬灭封片液，贴合细胞生长面于载玻片后，在荧光显微镜下观察并计数。结果表明，细胞发生明显的凋亡。Tunel染色分析：细胞传代用24孔板培养，培养6-10小时至贴壁，换成含1mM芸香苷的完全培养基，再培养24h，用全式金TUNEL试剂盒进行凋亡测定。实验操作步骤如下：(1)固定：24孔板中的贴壁细胞用PBS浸泡清洗1遍，使用甲醛固定液室温固定30min(每孔200μL)，随后用PBS润洗3次，每次5分钟。(2)通透：加入足量细胞通透液(每孔20μL)，室温静置5分钟。(3)阳性对照处理：将上述处理后的一个空白孔作为阳性对照细胞。向阳性对照组加入含DNaseI(终浓度10-15U/mL)的1×DNaseIReactionBuffer(100微升)，室温孵育30分钟。用细胞通透液润洗阳性对照样本3次，每次5分钟。(4)将50μL1×LabelingSolution与2μLTdT混匀后滴加至去除通透液的细胞表面，37℃水浴避光标记1小时。并设置只含50μL1×LabelingSolution的阴性对照组。(5)细胞通透液润洗3次，每次5分钟。本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种芸香苷抑制小鼠黑色素瘤细胞增殖并诱导其细胞凋亡的应用，其特征在于，包括：作用于小鼠B16‑F10黑色素瘤细胞的芸香苷工作液的配制方法以及对细胞增殖抑制与凋亡诱导的药物处理方法。
【技术特征摘要】
1.一种芸香苷抑制小鼠黑色素瘤细胞增殖并诱导其细胞凋亡的应用，其特征在于，包括：作用于小鼠B...
【专利技术属性】
技术研发人员：张丽丽，斯越秀，尹尚军，
申请(专利权)人：浙江万里学院，
类型：发明
国别省市：浙江,33
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