基于CdTe量子点聚集与循环酶双重放大信号的电化学发光生物传感器的构建及其应用制造技术

本发明专利技术公开了基于CdTe量子点聚集与循环酶双重放大信号的电化学发光生物传感器及其制备方法和应用。本发明专利技术制备水溶性的纳米球mSQSNSs，该材料聚集了大量的发光体CdTe QDs，拥有优良的电化学发光性质，其表面无毒的二氧化硅大大增强了其生物相容性，构建双信号放大的电化学发光生物传感器，较大的提高了生物传感器的灵敏度。本发明专利技术将磁性材料Fe3O4@Au NPs做为基地材料，其拥有超顺磁性、较大的比表面积、良好的生物相容性以及较强的催化能力等优点。本发明专利技术构建的电化学发光生物传感器利用碱基的互补配对提高了检测方法的特异性，设计的双重信号放大手段提高了检测的灵敏度，实现简单、快速和高灵敏检测。

Construction and application of electrochemiluminescence biosensor based on CdTe quantum dot aggregation and cyclic enzyme double amplification signal

The invention discloses an electrochemiluminescent biosensor based on the double amplification signal of CdTe quantum dot aggregation and circulating enzyme, and a preparation method and application thereof. The water-soluble nanosphere mSQSNSs is prepared by the invention. The material gathers a large number of luminescent CdTe QDs and has excellent electrochemiluminescent properties. The non-toxic silicon dioxide on the surface of the material greatly enhances its biocompatibility. The electrochemiluminescent biosensor with double signal amplification is constructed, which greatly improves the sensitivity of the biosensor. The magnetic material Fe3O4@Au NPs is used as the base material, which has the advantages of superparamagnetism, large specific surface area, good biocompatibility and strong catalytic ability. The electrochemiluminescence biosensor constructed by the invention improves the specificity of the detection method by using complementary base pairing, and the dual signal amplification method designed improves the sensitivity of the detection, realizing simple, fast and highly sensitive detection.

【技术实现步骤摘要】
基于CdTe量子点聚集与循环酶双重放大信号的电化学发光生物传感器的构建及其应用
本专利技术属于电化学发光生物传感器领域，具体涉及基于CdTe量子点聚集与循环酶双重放大信号的电化学发光生物传感器的构建及其应用，尤其涉及基于“西瓜式”信号单元的制备，以及与DSN酶的协同作用实现双重信号放大的电化学发光生物传感器的制备过程及其应用。
技术介绍
自Bard等人2002年首次报道了二氧化硅纳米晶体的ECL，许多新的发光试剂已被引入ECL系统。量子点(QDs)ECL发光体由于其独特的优点，比如尺寸可控，吸收广泛，较高的光化学稳定性和优异的生物相容性而备受关注。其中镉基QDs广泛应用于生物传感领域，我们的研究小组报道了使用CdTe或CdZnTeSQDs作为生物标记来检测癌胚抗原(CEA)的高选择性ECL生物传感器。另外，为了进一步提高灵敏度，我们的研究小组报告了一种基于纳米球负载大量量子点的方法，即将大量CdTe量子点嵌入到介孔二氧化硅纳米粒子(mSiO2NSs)中。然而，介孔结构不仅容易导致镉泄漏引起的细胞毒性，而且还导致电化学不稳定，采用无毒二氧化硅涂层量子点溶液处理上述mSiO2NSs，其优势显而易见。癌症是对人类健康最具有威胁和死亡率最高的一种疾病。对于癌症只有早发现、早治疗才能寻求一丝的生机。研究专家表明，miRNA的上调或下调表达与各种癌症的发生密切相关。通常约22个核苷酸长的微小RNA(miRNA)是单链，内源和非蛋白编码RNA，其作为基因表达的转录后调节因子起重要作用，并最终影响广泛的生物过程。所以，识别和检测miRNA在临床医学中有重要的意义。由于miRNA彼此短而高度同源，准确的识别和定量的检测还面临着巨大的挑战。最近，报道了许多检测miRNA的分析方法，包括荧光分析、电化学分析、光电化学分析、比色分析等。其中电化学发光分析因为其灵敏度高、背景信号低、操作简单而备受关注。
技术实现思路
专利技术目的：基于目前存在的刻蚀结构纳米球存在生物相容性低、电化学性能不稳定，本专利技术要解决的技术问题是提供了一种生物相容性高的“西瓜式”纳米材料(mSiO2@CdTe@SiO2,mSQS)。每个纳米材料包含许多的发光材料量子点，实现对发光信号的集合放大。另外其表面容易被官能化，为生物标记提供了极大的可能性。本专利技术制备了类似西瓜样式的纳米球(mSiO2@CdTe@SiO2，mSQSNSs)，其具有良好电化学发光(ECL)特性。mSQSNSs包含多个CdTe量子点(QDs)，并且比单个QD表现出更强的ECL信号。基于含有多个发光体的mSQSNSs与循环酶构建具有双重放大信号作用的电化学发光生物传感器并将其应用在miRNAs的检测。mSQSNSs用作ECL标记物以标记功能性寡核苷酸探针(DNA-F)。将具有超顺磁性、良好的生物相容性和分散性的Fe3O4@Au纳米颗粒制备为固定化基质，以加载发夹结构的DNA探针(DNA-P)。靶miRNAs与DNA-P杂交导致构象改变并形成RNA/DNA双链体。双链特异性核酸酶(DSN)可裂解双链体以释放miRNAs，miRNAs被循环利用与发夹DNA杂交。此后，mSQSNSs标记的DNA-F与剩下的DNA-P之间的杂交互补构建得到电化学发光生物传感器。获得的电化学发光生物传感器将通过磁铁的作用聚集在电极的表面上。获得的ECL信号表明mSQSNSs在生物传感器中具有很大的应用潜力。本专利技术还要解决的技术问题是基于以上的材料mSQS，提供构建电化学发光生物传感器及其制备方法。本专利技术还要解决的技术问题是提供了生物传感器的应用，为了提高生物传感器的灵敏度，巧妙的设计两条DNA探针序列，利用DSN酶，将目标miRNAs循环利用，再次实现信号的循环放大。本专利技术最后所要解决的技术问题是提供了基于“西瓜式”的纳米材料和DNS酶构建的电化学发光传感器进行miRNAs的检测方法。技术方案：为了解决上述技术问题，本专利技术是通过以下方案来实现的：基于CdTe量子点聚集与循环酶双重放大信号的电化学发光生物传感器，所述电化学发光生物传感器包括纳米球构建的信号单元mSQS/DNA-F、非特异性结合位点被封闭的磁性探针Fe3O4@AuNPs/DNA-P、以及DSN酶，所述信号单元mSQS/DNA-F为纳米球mSQSNSs标记的功能性探针DNA-F，所述磁性探针Fe3O4@AuNPs/DNA-P为表面负载发夹结构探针DNA-P的Fe3O4@AuNPs，所述Fe3O4@AuNPs为表面负载Au纳米粒子的Fe3O4。该电化学发光生物传感器包括类似西瓜样式的纳米球组装的信号单元(mSQS/DNA-F)的构建、磁性探针(Fe3O4@AuNPs/DNA-P)非活性位点的封闭、DSN酶的信号放大作用、信号单元与磁性探针的识别互补。其中，所述功能性探针DNA-F和发夹结构探针DNA-P是根据miRNAs的碱基序列设计得到，所述发夹结构探针DNA-P与目标物miRNAs的互补配对发生构象变化得到，功能性探针DNA-F与发夹结构探针DNA-P酶切后剩余部分的序列互补。其中，所述信号单元mSQS/DNA-F的制备方法包括以下步骤：1)纳米球mSQSNSs的制备及氨基化；2)使戊二醛与表面氨基化的mSQSNSs反应，获得戊二醛功能化的mSQSNSs；3)使所述的功能性探针DNA-F与步骤2)得到的戊二醛功能化的mSQSNSs反应，通过戊二醛的交联反应将所述功能性探针DNA-F结合到mSQSNSs的表面，获得信号单元mSQS/DNA-F。其中，为了获得优良的电化学发光性能，所述纳米球mSQSNSs的粒径为500-600nm。上述表面氨基化的mSQSNSs可通过现有方法获得；优选地，上述表面氨基化的的mSQSNSs制备方法为：1)CdTeQDs的制备称取的CdCl2﹒2.5H2O溶于二次蒸馏水中(CdCl2浓度为2-3mg/mL)，之后加入三巯基丙胺(MPA)，用NaOH溶液将pH调至11-12。加入1-2mmol/L的NaHTe前驱体到上述溶液中，将溶液加热至110-120℃，冷凝回流的条件下加热8-10h。NaHTe前驱体的制备方法如下：将盛有二次蒸馏水三口烧瓶通氮气10-15min，使得三口烧瓶中的空气排出，之后加入0.03-0.05mM的Te粉以及0.8-1.2mM的NaHB4，将反应加热至70-90℃持续时间25-35min。2)二氧化硅(sSiO2)的制备二次蒸馏水、无水乙醇和的氨水(28％)(体积比为5:4:3)依次加入三口烧瓶中，搅拌均匀后，快速加入20-30mL的原硅酸四乙酯(TEOS)，室温下剧烈搅拌12-13h。多次离心洗涤，干燥得到二氧化硅(sSiO2)。3)二氧化硅的刻蚀(mSiO2)称取一定量的sSiO2彻底分散于二次蒸馏水中(sSiO2浓度为10-15mg/mL)，加入2mL的NaOH(0.1-0.15g/mL)刻蚀液室温下搅拌12-13h。经过多次离心洗涤，干燥得到刻蚀二氧化硅(mSiO2)。4)mSiO2的氨基化称取一定量的mSiO2彻底分散于的甲醇中(mSiO2浓度为12-15mg/mL)，超声分散使其完全溶解，随后加入2-2.5mL的(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷(APTES)进行氨基化，室温下搅拌23-24h本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.基于CdTe量子点聚集与循环酶双重放大信号的电化学发光生物传感器，其特征在于，所述电化学发光生物传感器包括纳米球构建的信号单元mSQS/DNA‑F、非特异性结合位点被封闭的磁性探针Fe3O4@AuNPs/DNA‑P以及DSN酶，所述信号单元mSQS/DNA‑F为纳米球mSQSNSs标记的功能性探针DNA‑F，所述磁性探针Fe3O4@AuNPs/DNA‑P为表面负载发夹结构探针DNA‑P的Fe3O4@Au NPs，所述Fe3O4@Au NPs为表面负载Au纳米粒子的Fe3O4。

【技术特征摘要】
1.基于CdTe量子点聚集与循环酶双重放大信号的电化学发光生物传感器，其特征在于，所述电化学发光生物传感器包括纳米球构建的信号单元mSQS/DNA-F、非特异性结合位点被封闭的磁性探针Fe3O4@AuNPs/DNA-P以及DSN酶，所述信号单元mSQS/DNA-F为纳米球mSQSNSs标记的功能性探针DNA-F，所述磁性探针Fe3O4@AuNPs/DNA-P为表面负载发夹结构探针DNA-P的Fe3O4@AuNPs，所述Fe3O4@AuNPs为表面负载Au纳米粒子的Fe3O4。2.根据权利要求1所述的电化学发光生物传感器，其特征在于，所述功能性探针DNA-F和发夹结构探针DNA-P是根据miRNAs的碱基序列设计得到，所述发夹结构探针DNA-P与目标物miRNAs的互补配对发生构象变化得到，功能性探针DNA-F与发夹结构探针DNA-P酶切后剩余部分的序列互补。3.权利要求1或2所述的电化学发光生物传感器，其特征在于，所述信号单元mSQS/DNA-F的制备方法包括以下步骤：1）纳米球mSQSNSs的制备及氨基化；2）使戊二醛与表面氨基化的mSQSNSs反应，获得戊二醛功能化的mSQSNSs；3）使所述的功能性探针DNA-F与步骤2）得到的戊二醛功能化的mSQSNSs反应，通过戊二醛的交联反应将所述功能性探针DNA-F结合到mSQSNSs的表面，获得信号单元mSQS/DNA-F。4.根据权利要求1~3任一项所述的电化学发光生物传感器，其特征在于，所述纳米球mSQSNSs的粒径为500-600nm。5.根据权利要求1或2所述的电化学发光生物传感器，其特征在于，所述所述非特异性结合位点被封闭的磁性探针Fe3O4@AuNPs/DNA-P的制备方法包括以下步骤：1）Fe3O4@AuNPs的制备；2）探针DNA-P在TCEP的作用下高温处理，获得发夹结构探针DNA-P；3）经过简单的处理，通过Au-S键的结合发夹结构探针DNA-P负载到Fe3O4@AuNPs的表面；4）使用6-巯基-1-己醇和牛...

【专利技术属性】
技术研发人员：丁收年，朱红允，梁秀丽，赵春芹，左家莹，武锡锦，闫其报，刘金霞，徐来弟，陆天，朱凯迪，温雪飞，
申请(专利权)人：东南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32