多指标联用比较固定化链亲和素分离性能的方法技术

多指标联用比较固定化链亲和素分离性能的方法，特征如下：生物素化牛小肠粘膜碱性磷酸酶缩写为Bio‑AP；固定化链亲和素对Bio‑AP饱和结合量为其对生物素化大分子饱和结合量；用显色团、单个生物素基团、磺酸或羧酸及骨架连接成1000 Dalton以下水溶性生物素化小分子显色探针，固定化链亲和素对生物素化小分子显色探针结合容量换算出活性亚基量即活性蛋白量；固定化链亲和素对生物素化大分子饱和结合量与其活性亚基量的比值为比活性；测定对设定量Bio‑AP全分离时固定化链亲和素最小需要量；对固定化链亲和素的参考品，在相同条件下分别测定各自上述四个性能指标的均值和标准差；所选参考品与样品的多个性能指标进行比较，四个指标都统计无差异则二者分离性能一致。

Comparison of Separation Performance of Immobilized Chain Avidin by Multiple Indicators

The methods for comparing the separation performance of immobilized streptavidin were characterized as follows: biotinylated bovine intestinal mucosal alkaline phosphatase abbreviated as Bio_AP; saturated binding capacity of immobilized streptavidin to Bio_AP to biotinylated macromolecules; water-soluble biotinylation below 1000 Dalton with chromophore, single biotin group, sulfonic acid or carboxylic acid and skeleton. The binding capacity of immobilized chain avidin to biotinylated small molecule chromogenic probe was converted to the amount of active subunit, i.e. the amount of active protein; the ratio of saturated binding capacity of immobilized chain avidin to the amount of active subunit of biotinylated macromolecule was specific activity; the minimum requirement of immobilized chain avidin for complete separation of set amount Bio AP was determined; Reference, under the same conditions, the mean and standard deviation of each of the above four performance indicators were measured respectively; the selected reference was compared with several performance indicators of the sample, and the separation performance of the two indicators was the same if the four indicators were all statistic no difference.

【技术实现步骤摘要】
多指标联用比较固定化链亲和素分离性能的方法
本专利技术属于生物
，涉及定量表征固定化链亲和素亲和分离性能的指标及其测定方法，是这类生物技术产品质量控制及指导其制备工艺优化的关键技术。本专利技术所述固定化链亲和素分离性能的主要指标及其定量测定方法，也适合表征标记用固定化链亲和素，如链亲和素与磁纳米粒或量子点的加合物，但对应指标反映间接亲和固定化生物素化成分的性能。分离用固定化链亲和素中所用固体材料本身对分离性能也有显著影响，但本专利技术不涉及对固体材料本身性能的测定和比较。
技术介绍
生物素的脂肪族羧基易于活化后修饰各类生物分子的脂肪族氨基。亲和素和链亲和素对游离生物素及生物素修饰(也称生物素化)成分有很高选择性结合能力即亲和力。亲和素是真核蛋白；链亲和素是一种原核蛋白，易于重组表达和纯化，其应用成本也更低，在生物
应用也就更广。将链亲和素固定在固体材料表面，尤其是微纳米材料表面，通过固定化链亲和素对生物素化目标分子的高亲和力结合，能实现生物素化目标分子基于亲和作用高选择性分离、间接固定化或间接偶联/标记；这是生物
广泛应用的生物分子固定化、分离及标记/偶联技术，是构建各类高选择性分离分析系统的核心子系统。对应地，分离用固体材料和链亲和素的加合物即本专利技术所述固定化链亲和素就是重要的生物材料和生物技术产品；此类产品的典型代表，是链亲和素和超顺磁微米颗粒(磁珠)的共价加合物即链亲和素磁珠，这是单价超过黄金的生物亲和分离材料。固定化链亲和素作为生物分离材料，其每批次产品的分离性能需严格一致才能保障其用于分离分析的重现性和结果可靠性。固定化链亲和素作为分离材料多数是混悬液，其有效成分的浓度是其分离性能的决定因素，但其有效成分的含量很难准确测量，尤其在使用中其分离性能还受到很多因素及亲和作用对象结构性质的影响。固定化链亲和素的生物亲和分离性能依赖于链亲和素对生物素化成分的结合；固定化链亲和素对选定生物素化分子探针的结合活性正比于样品中有效成分的含量，是表征其分离性能的基本指标。固定化链亲和素对生物素化分子亲和力比对游离生物素亲和力低，需要测定饱和结合活性才有较好重现性。然而，生物素化分子探针的体积大小对固定化链亲和素饱和结合活性有显著影响；单用固定化链亲和素对生物素化分子探针饱和结合活性无法可靠判断其分离性能，尤其是任何实验测定存在的误差会对产品分离性能判断造成很大不确定性。理论上，对分离用固定化链亲和素，将有明确物理意义的多项独立指标及关联指标联用组成定量比较体系，并建立精确测量方法，基于多指标联用比较有望更精确地定量比较其分离性能和更严格地确认不同批次产品分离性能的一致性。显然，用于判断的部分指标应该与固定化链亲和素活性成分的含量或其浓度紧密相关，但也必须有部分与固定化链亲和素活性成分含量无关而对其结构性因素很敏感的指标用于比较。所以，建立用于定量比较固定化链亲和素分离性能的指标体系时，除了与样品中有效成分含量紧密相关的指标，还要有与样品中活性成分含量无关的指标。每个完整链亲和素蛋白分子有四个相同的活性位点。有多种方法能在固体材料表面固定化链亲和素。非共价键固定化链亲和素依赖于原子之间在近距离内才有效的物理吸附；这种方式固定化链亲和素的活性位点周围有较大空间位阻，其对生物素化大分子结合活性通常较低，分离性能也低，尤其吸附固定化链亲和素会解离，造成产品储存稳定性及货架周期不足，故应用很少。在共价固定化方案中，链亲和素与固体材料本体间用共价键作为连接臂；如链亲和素与固体材料本体间的连接臂很短，则固定化链亲和素活性位点周围仍有较大位阻，其结合生物素化小分子探针的活性可以很高但结合生物素化大分子的活性就偏低。显然，链亲和素和固体材料本身之间共价连接臂应有适当长度。但是，即使用适当长度的共价连接臂，固定化链亲和素的不同亚基周围的空间位阻不同，也会影响不同亚基对生物素化成分的表观亲和力和结合活性，尤其是生物素化大分子探针的结合活性。另一方面，用于通过共价键连接固定化链亲和素的固体材料表面可用活泼官基团周围位阻常有差异，即这类固体材料表面不均匀。相应地，在固体材料表面不同位置固定化链亲和素分子对生物素化大分子探针表观亲和力不一致；这种不一致的表观亲和力对分离用固定链亲和素是性能缺陷，属于固定化链亲和素性能本身这种内因，只能通过优化固体材料表面结构来解决。更特殊的是，固定化链亲和素的不同分子及其不同亚基表观亲和力差异对过量生物素化大分子探针饱和结合活性影响较小，但对全分离设定量生物素化大最小需要量影响显著。因为，实现全分离时理论上没有任何成分是显著过量，但当固定化链亲和素的不同分子表观亲和力相差很大时，就会使得固定化链亲和素中小分子探针可结合的位点无法结合生物素化大分子探针，造成其分离性能降低。在固体材料表面采用较长柔性连接臂共价固定化链亲和素，其活性位点周围位阻就会显著降低而使其不同固定化链亲和素分子，甚至相同链亲和素分子的不同亚基，对生物素化大分子表观亲和力更一致，用于全分离设定量生物素化大分子的最小需要量就更小，分离性能更高而应用价值就更高。显然，理想的分离用固定化链亲和素，其对生物素化大分子探针结合活性应接近游离链亲和素，即其比活性应该与游离链亲和素尽可能接近；这是优化固定化链亲和素制备工艺的目标。另一方面，无论用何种测量方法都存在测定误差，单用任何指标比较固定化链亲和素分离性能的不确定度仍很高。用固定化链亲和素对生物素化大分子探针饱和结合活性、所含链亲和素活性蛋白量、固定化链亲和素比活性、全分离设定量生物素化大分子最小需要量这四个指标的部分或全部组合，联用于比较固定化链亲和素分离性能就是本专利技术的核心内容。理论上，固定化链亲和素比活性与其活性成分浓度无关，适合反映固定化链亲和素分离性能的内在结构性差异，也是判断样品中活性成分浓度差异的重要指标。上述与固定化链亲和素分离性能相关的定量指标都需简便方法精确测定。测定固定化链亲和素所含活性蛋白量、对生物素化大分子探针饱和结合活性及对设定量生物素化大分子探针全分离的最小需要量，最经典方法是用放射性同位素标记的生物素化大分子及小分子生物素衍生物为探针。例如，用放射性同位素标记的生物素化寡核苷酸测定对生物素化大分子探针饱和结合容量，用放射性标记生物素或其小分子衍生物探针(分子量小于1000Dalton)测定结合容量换算出活性亚基量及活性蛋白量，是固定化链亲和素产品分离性能的最常用测定方法。但是，放射性同位素对人体和环境危害都很大，其残留物难以处理，标记物比活性和标记信号浓度难以标定。用荧光或发光信号标记生物素化大分子或生物素化小分子作为探针也能测定上述指标，但需贵重专用仪器，这类标记物稳定性差且难以标定其含量。所以，需要建立更简便实用的方法测定上述分离性能相关指标。光度法测量吸收简单可靠且易于标准化；水解酶催化显色底物反应的产物吸收能有效测定，其水解活性测定体系与多数固定化材料相容；显色探针浓度易于据其消光系数和吸收进行标定。显然，用设定量生物素化水解酶为探针测定其全分离时固定化链亲和素最小需要量更简便可行。选择用生物素化水解酶为探针显色测定固定化链亲和素对生物素化大分子饱和结合活性、用小分子显色探针测定固定化链亲和素活性蛋白量、据前两个指标推算固定化链亲本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.多指标联用比较固定化链亲和素分离性能的方法，特征在于：(1) 选择如下四个指标表征固定化链亲和素的分离相关性能，具体是，固定化链亲和素对生物素化大分子探针的饱和结合量、固定化链亲和素的活性亚基量即其活性蛋白量、固定化链亲和素对生物素化大分子饱和结合量相对于其活性蛋白量的比值为其比活性、固定化链亲和素对设定量生物素化大分子探针全分离的最小需要量；(2) 用生物素化牛小肠粘膜碱性磷酸酶为生物素化大分子探针，光度法测定固定化链亲和素对生物素化大分子饱和量、固定化链亲和素对设定量生物素化大分子探针全分离的最小需要量表示分离效价；用分子量1000 Dalton以下含显色团、羧基或磺酸增溶的水溶性生物素化小分子显色探针，光度法测定固定化链亲和素活性亚基量，并用于推算固定化链亲和素的比活性；(3) 对固定化链亲和素的参考品和样品，在相同条件下分别测定各自上述四个指标的均值和标准差；参考品重复取样不少于5次进行测定，样品至少重复取样1次进行测定；(4) 实践中，按如下所述，判断固定化链亲和素的参考品与样品分离性能是否一致：选上述四个指标中任两个、任三个或四个联用进行统计比较，如样品的每个所选指标与参考品的相同指标在...

【技术特征摘要】
1.多指标联用比较固定化链亲和素分离性能的方法，特征在于：(1)选择如下四个指标表征固定化链亲和素的分离相关性能，具体是，固定化链亲和素对生物素化大分子探针的饱和结合量、固定化链亲和素的活性亚基量即其活性蛋白量、固定化链亲和素对生物素化大分子饱和结合量相对于其活性蛋白量的比值为其比活性、固定化链亲和素对设定量生物素化大分子探针全分离的最小需要量；(2)用生物素化牛小肠粘膜碱性磷酸酶为生物素化大分子探针，光度法测定固定化链亲和素对生物素化大分子饱和量、固定化链亲和素对设定量生物素化大分子探针全分离的最小需要量表示分离效价；用分子量1000Dalton以下含显色团、羧基或磺酸增溶的水溶性生物素化小分子显色探针，光度法测定固定化链亲和素活性亚基量，并用于推算固定化链亲和素的比活性；(3)对固定化链亲和素的参考品和样品，在相同条件下分别测定各自上述四个指标的均值和标准差；参考品重复取样不少于5次进行测定，样品至少重复取样1次进行测定；(4)实践中，按如下所述，判断固定化链亲和素的参考品与样品分离性能是否一致：选上述四个指标中任两个、任三个或四个联用进行统计比较，如样品的每个所选指标与参考品的相同指标在P<0.05置信限水平都无统计差异，则二者分离性能一致；或者，选上述四个指标中任两个、任三个或四个联用进行简化比较，当样品的每个所选指标两次测定相差小于10%、其均值与参考品相同指标均值的偏差都小于参考品标准差的2倍，则二者分离性能一致；如参考品与样品的比活性一致而其它任意指标有差异，则二者有效成分的浓度有差异；通过调整样品的稀释度或浓缩度，获得分离性能与参考品无差异的样品。2.据权利要求1所述，光度法测定固定化链亲和素分离性能的四个指标，测定过程特征如下：(1)固定化链亲和素对生物素化大分子饱和结合量：用生物素化牛小肠粘膜碱性磷酸酶为生物素化大分子探针缩写为Bio-AP；结合反应体系pH6.5~8.5，Bio-AP相对于固定化链亲和素结合容量过量至少1倍，达到平衡后分离出吸附Bio-AP；用4-硝基苯基磷酸酯或...

【专利技术属性】
技术研发人员：廖飞，龙高波，谢万军，
申请(专利权)人：重庆博蓝鹰生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：重庆,50