一种细胞玻璃化冷冻液及冷冻方法技术

本发明专利技术属于冷冻领域，提供了一种细胞玻璃化冷冻液及冷冻方法，所述冷冻液包括涮洗液、平衡液和玻璃化液。本发明专利技术的冷冻液减少在平衡液及玻璃化液里面的作用时间，降低渗透性保护剂的化学毒性，且操作简单，细胞存活率高。

A Cell Vitrification Refrigerant and Its Freezing Method

The invention belongs to the field of freezing, and provides a cell vitrification freezing liquid and a freezing method. The freezing liquid includes rinsing liquid, balance liquid and vitrification liquid. The refrigerant reduces the action time in the equilibrium liquid and vitrification liquid, reduces the chemical toxicity of the osmotic protectant, and has simple operation and high cell survival rate.

【技术实现步骤摘要】
一种细胞玻璃化冷冻液及冷冻方法
本专利技术属于冷冻领域，涉及细胞的玻璃化冷冻。
技术介绍
“玻璃化”的概念是指水或者溶液快速降温达到或低于-110～-100℃的温度范围时，形成一种高黏度的介于液态和固态之间、非晶体的、透明的玻璃态。因此。玻璃化冷冻技术的基本原理就是用高浓度的冷冻保护剂溶液将细胞内水分置换出来，经急速降温由液态转化为外形似玻璃状的非晶体状固体状态，这一状态的变化无冰晶形成，避免了冰晶形成对细胞脂质膜及细胞骨架结构的损伤。1998年，Mukaida等首次采用玻璃化技术冻贮胚胎并移植获得成功。后来玻璃化冷冻技术冻存原核期胚胎、分裂期胚胎和囊胚等不同发育阶段的胚胎相继取得成功。2000年，Saito等应用乙二醇(EG)为基础的玻璃化冷冻保护剂成功冻存了人类8细胞胚胎，并获得较高的胚胎复苏存活率。同年有学者采用EG和蔗糖(sucrose)做冷冻保护液冻存了215个发育到第三天的卵裂期胚胎，获得了49.3％的冻融后存活率。近十几年来，玻璃化冷冻技术获得了很大的进步，冻融后存活率得到了较大的提高。又因为囊胚期胚胎相较于卵裂期胚胎具有更好的发育潜能和耐冷冻损伤性，因此囊胚期胚胎的玻璃化冷冻逐渐替代卵裂期胚胎的玻璃化冷冻，成为胚胎保存的一大重要手段，并在全世界大部分生殖中心广泛使用。囊胚期的玻璃化冷冻液从生物化学特性上分为渗透性冷冻保护剂、非渗透性冷冻保护剂和其他冷冻保护剂。渗透性冷冻保护剂主要有二甲基亚砜(DMSO)和醇类(乙二醇(EG)、丙二醇(PROH)、丙三醇(甘油))。非渗透性冷冻保护剂通常使用均为小分子的糖类，如单糖、双糖或三糖等，蔗糖、棉籽糖、葡萄糖、果糖等都曾作为非渗透性冷冻保护剂，但目前在胚胎冷冻保存中广泛使用的仅蔗糖。其他冷冻保护剂包括白蛋白、聚乙烯吡咯烷酮(pvp)、右旋糖酐、羟乙基淀粉等。目前公知的、辅助生殖临床广泛使用的玻璃化冷冻液为平衡液为7.5％(V/V)乙二醇(EG)+7.5％(V/V)二甲亚砜(DMSO)或7.5％(V/V)EG+7.5％(V/V)丙二醇(PROH)，玻璃化液为15％(V/V)EG+15％(V/V)DMSO+0.5mol/L蔗糖或15％(V/V)EG+15％(V/V)PROH+0.5mol/L蔗糖。此类冷冻液在使用操作中，平衡液需平衡5～10min，玻璃化液需放置1～2min，整个冷冻操作耗时较长。
技术实现思路
针对以上所述的原有公知的玻璃化冷冻液冷冻方法耗时较长的问题，本专利技术提供一种稳定性高、冷冻保护效果更佳的玻璃化冷冻保护液，以解决目前存在的问题。第一个方面，本专利技术提供一种玻璃化冷冻液，包括涮洗液(BS)、平衡液(BV1)和玻璃化液(BV2)，其中，所述的涮洗液(BS)包括基础液和蛋白添加物，主要作用为涮洗掉待冷冻囊胚由培养环境带来的培养液；所述基础液为改良的人输卵管液(modifiedhumantubalfluid，mHTF)、TCM199或平衡盐溶液PBS等，所述蛋白添加物为在涮洗液中终浓度为2％～10％(V/V)的人血清白蛋白(HSA)或血清替代物(SerumSubstituteSupplement，SSS)等；作为一个优选方案，所述涮洗液所含的基础液为改良的人输卵管液，蛋白添加物为人血清白蛋白，优选地，所述人血清白蛋白的添加量为5％(V/V)；所述的平衡液(BV1)包含占平衡液体积5％～10％(V/V)的乙二醇(EG)和5％～10％(V/V)的二甲亚砜(DMSO)，余量为涮洗液，或者包含占平衡液体积5％～10％(V/V)的EG和5％～10％(V/V)的丙二醇(PROH)，余量为涮洗液(BS)；作为一个优选方案，所述平衡液包含占平衡液体积7.5％(V/V)的乙二醇+7.5％(V/V)的二甲亚砜，余量为涮洗液(BS)；所述玻璃化液(BV2)包含占玻璃化液体积10％～20％(V/V)的乙二醇(EG)、10％～20％(V/V)的二甲亚砜、0.2～1.0mol/L海藻糖和5～30mg/ml聚蔗糖(Ficoll)，余量为涮洗液(BS)，或者包含占玻璃化液体积10％～20％(V/V)的乙二醇、10％～20％(V/V)的丙二醇、0.2～1.0mol/L海藻糖和5～30mg/ml聚蔗糖(Ficoll)，余量为涮洗液(BS)；优选地，所述玻璃化液(BV2)包含占玻璃化液体积15％(V/V)的乙二醇、15％(V/V)的二甲亚砜、0.65mol/L海藻糖和10mg/ml聚蔗糖(Ficoll)，余量为涮洗液(BS)。在第二个方面，提供一种使用本专利技术的冷冻液的冷冻细胞方法，包括步骤：将细胞利用激光进行皱缩，分别经涮洗液涮洗2-40秒、经平衡液作用1分钟～4分钟和经玻璃化液作用10秒～40秒后，装载于玻璃化冷冻载体后投入液氮保存。作为一个优选方案，将细胞利用激光进行皱缩，分别经涮洗液涮洗5-10秒、经平衡液作用2分钟和经玻璃化液作用30秒后，装载于玻璃化冷冻载体后投入液氮保存。优选地，所述方法中凡涉及液体置换的步骤均在温台上操作，温台温度在35-39摄氏度之间，优选的温台温度为37摄氏度。优选地，所述细胞为非人哺乳动物的囊胚期胚胎，为胚胎发育到囊胚期阶段的四期、五期及六期囊胚，所述非人哺乳动物如兔子和小鼠。所述的激光可为各类波长及颜色的激光，作为一个优选方案选用1480nm的红外激光。本专利技术的优点在于：(1)细胞在进入涮洗液前先用激光进行皱缩，可使囊腔尽可能的皱缩，减少在平衡液及玻璃化液里面的作用时间，降低渗透性保护剂的化学毒性。(2)用保护效果更好的海藻糖代替蔗糖，并添加聚蔗糖，更有利于提高囊胚胞膜的稳定性，使囊胚更耐受渗透损伤，有助于提高复苏囊胚的存活率。海藻糖是由两个葡萄糖基分子通过半缩醛基缩合而成的非还原性双糖，最初被发现于1832年，早期的研究只知道海藻糖是一种能量的储存形式，1985年之后，研究才逐渐发现海藻糖的许多不同于其他双糖的特殊功效。研究发现海藻糖在对生物的抗脱水、抗冷冻、抗高渗保护、对生物制品的干燥与保存等不同方面的保护作用均优于自然界中如蔗糖、葡萄糖等其他糖类。(3)操作简单，不同熟练程度的操作者均可获得非常稳定的高存活率，操作时间较短，更有利于大批量的囊胚冷冻操作。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术作进一步说明，但本专利技术的内容不限于此。以下实施例中，如果没有特殊说明，所使用的试剂和仪器都是本领域常规试剂和仪器，可以通过商购方式获得；所使用的基础操作都是本领域常规方法，本领域技术人员根据描述的内容可以实现所述操作并得到相应的结果。其中，HSA(Vitrolife-10064)，mHTF(SAGE-18200226)，EG(SIGMA-102466)，DMSO(SIGMA-D2650)，海藻糖(SIGMA-T0167)，Ficoll(SIGMA-F2878)。以下实施例中使用的兔子和小鼠的囊胚，均来自于本实验室，任何商购的兔子或小鼠的囊胚均可使用。实施例1：玻璃化冷冻液的配制方法：1.以10ml为例配制涮洗液(BS)，含5％(V/V)的人血清白蛋白(HSA)的改良的人输卵管液(mHTF)，即取9.5ml的mHTF，再加入0.5ml的HSA。2.以10ml为例配制平衡液(BV1)，含7.5％(V/V)乙二醇(EG)+7.5％(V/V)二甲亚砜本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种玻璃化冷冻液，包括涮洗液、平衡液和玻璃化液，其中，所述的涮洗液包括基础液和蛋白添加物，所述基础液为改良的人输卵管液、TCM199或平衡盐溶液PBS，所述蛋白添加物为在涮洗液中终浓度为2％～10％(V/V)的人血清白蛋白或血清替代物；所述的平衡液包含占平衡液体积5％～10％(V/V)的乙二醇和5％～10％(V/V)的二甲亚砜，余量为涮洗液，或者包含占平衡液体积5％～10％(V/V)的乙二醇和5％～10％(V/V)的丙二醇，余量为涮洗液；所述玻璃化液包含占玻璃化液体积10％～20％(V/V)的乙二醇、10％～20％(V/V)的二甲亚砜、0.2～1.0mol/L海藻糖和5～30mg/ml聚蔗糖，余量为涮洗液，或者包含占玻璃化液体积10％～20％(V/V)的乙二醇、10％～20％(V/V)的丙二醇、0.2～1.0mol/L海藻糖和5～30mg/ml聚蔗糖，余量为涮洗液。

【技术特征摘要】
1.一种玻璃化冷冻液，包括涮洗液、平衡液和玻璃化液，其中，所述的涮洗液包括基础液和蛋白添加物，所述基础液为改良的人输卵管液、TCM199或平衡盐溶液PBS，所述蛋白添加物为在涮洗液中终浓度为2％～10％(V/V)的人血清白蛋白或血清替代物；所述的平衡液包含占平衡液体积5％～10％(V/V)的乙二醇和5％～10％(V/V)的二甲亚砜，余量为涮洗液，或者包含占平衡液体积5％～10％(V/V)的乙二醇和5％～10％(V/V)的丙二醇，余量为涮洗液；所述玻璃化液包含占玻璃化液体积10％～20％(V/V)的乙二醇、10％～20％(V/V)的二甲亚砜、0.2～1.0mol/L海藻糖和5～30mg/ml聚蔗糖，余量为涮洗液，或者包含占玻璃化液体积10％～20％(V/V)的乙二醇、10％～20％(V/V)的丙二醇、0.2～1.0mol/L海藻糖和5～30mg/ml聚蔗糖，余量为涮洗液。2.根据权利要求1所述的冷冻液，其中，所述涮洗液中所含的基础液为改良的人输卵管液，蛋白添加物为人血清白蛋白，其中，所述人血清白蛋白的添加量为5％(V/V)。3.根据权利要求1所述的冷冻液，其中，所述平衡液包含占平衡液体积7.5％(V/V)的乙二醇和7.5％(V/V...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈子江，吴克良，李城，马金龙，
申请(专利权)人：陈子江，山东山大附属生殖医院有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37