间充质干细胞冻存液、制备方法及其冻存方法技术

本发明专利技术公开了一种间充质干细胞冻存液、制备方法及其冻存方法。其中，所述冻存液由配合使用的A液和B液组成；所述A液按照体积百分比计算，包括如下成分：DMEM培养基70‑80％；PSG1‑2％；FBS20‑30％；β‑疏基乙醇0.1‑0.3％；所述B液按照体积百分比计算，包括如下成分：DMEM培养基78‑80％；PSG 1‑2％；DMSO20％。该冻存液使用时可以避免含DMSO的冻存液直接混匀细胞沉淀，缩短二甲基亚砜与细胞的接触时间，降低其对于细胞的毒性，从而有效的提高细胞冻存后，细胞复苏时的得率和存活率。

Mesenchymal stem cells cryopreservation solution, preparation method and cryopreservation method

The invention discloses a mesenchymal stem cell cryopreservation solution, a preparation method and a cryopreservation method thereof. Among them, the cryopreservation solution is composed of A liquid and B liquid which are used together. The A liquid is calculated according to volume percentage, including the following components: DMEM medium 70 80%; PSG1 2%; FBS 20 30%; beta sparse ethanol 0.1 0.3%; The B liquid is calculated according to volume percentage, including the following components: DMEM medium 78 80%; PSG 1 2%; DMSO 20%. The cryopreservation solution can avoid the direct mixing of DMSO-containing cryopreservation solution to precipitate cells, shorten the contact time between DMSO and cells, reduce the toxicity of DMSO to cells, and effectively improve the recovery rate and survival rate of cells after cryopreservation.

【技术实现步骤摘要】
间充质干细胞冻存液、制备方法及其冻存方法
本专利技术涉及细胞冻存
，尤其涉及一种间充质干细胞冻存液、制备方法及其冻存方法。
技术介绍
间充质干细胞是一群中胚层来源的具有自我更新和多向分化潜能的多能干细胞，其在骨髓、胎盘、脐带、羊膜、肌肉、脐血等组织中广泛存在。由于这种间充质干细胞具有取材方便、体外扩增简单迅速等优点，在临床细胞治疗中具有广阔的应用前景，可用于治疗红斑狼疮和硬皮病等自身免疫性疾病，降低细胞或器官移植后的免疫排斥反应，提高细胞或器官移植的成功率等。国内外已将间充质干细胞应用于大量的动物试验及临床研究中。间充质干细胞从生物体组织块中取材以后，可以通过简单的细胞培养方法进行大量扩增。在实际的使用过程中，扩增后获得的间充质干细胞有时需要被冻存起来，以备于科研及临床时随时复苏使用。一般的细胞冻存过程为：将需要冻存的细胞加入冻存液后分装到冻存管中，封口后逐渐阶梯式降温后，移动至液氮罐中进行低温长期保存。在需要重新使用这些细胞时，则将冻存管从液氮罐中取出并进行细胞复苏。在实现本专利技术的过程中，申请人发现现有技术中存在如下问题：在进行细胞冻存时，需要向细胞加入冻存液以保护细胞。现有的细胞冻存液是通用的冻存液，通常是由10％DMSO、10％胎牛血清以及80％基础培养基组成。但是这种配方和方法冻存脐带间充质干细胞均效果不理想，复苏后的细胞得率和活率均较低，不利于冻存后细胞的使用。
技术实现思路
鉴于上述现有技术的不足之处，本专利技术的目的在于提供一种间充质干细胞冻存液、制备方法及其冻存方法，旨在解决现有技术中细胞冻存液冻存效果不理想，细胞复苏效果不佳的问题。为了达到上述目的，本专利技术实施例第一方面提供一种间充质干细胞冻存液。所述冻存液由配合使用的A液和B液组成；所述A液按照体积百分比计算，包括如下成分：所述B液按照体积百分比计算，包括如下成分：DMEM培养基78-80％PSG1-2％DMSO20％。可选地，所述A液按照体积百分比计算，包括如下成分：所述B液按照体积百分比计算，包括如下成分：DMEM培养基79％PSG1％DMSO20％。本专利技术实施例第二方面提供一种间充质干细胞冻存液的制备方法，其特征在于，包括：按体积百分比计算，将70-80％的DMEM培养基、1-2％的PSG，20-30％的FBS以及0.1-0.3％的β-疏基乙醇混合均匀，制备A液；按体积百分比计算，将78-80％的DMEM培养基、1-2％PSG以及20％的DMSO混合均匀，制备B液：将所述A液和所述B液放置在4℃中保存备用。可选地，按体积百分比计算，所述A液由如下成分混合均匀形成：78.8％的DMEM培养基、1％的PSG，20％的FBS以及0.2％的β-疏基乙醇；按体积百分比计算，所述B液由如下成分混合均匀形成：79％的DMEM培养基、1％PSG以及20％的DMSO。本专利技术实施例第三方面提供应用如上所述的间充质干细胞冻存液的细胞冻存方法。所述细胞冻存方法包括如下步骤：收集间充质干细胞；按照预定的比例，先向所述间充质干细胞加入A液，将间充质干细胞沉淀充分混匀，获得第一细胞悬液；然后向第一细胞悬液中加入与A液等体积B液并充分混匀后，获得第二细胞悬液；将所述第二细胞悬液分装至若干根冻存管并封口；按预定降温程序对所述冻存管进行降温后，将冻存管移入液氮罐保存。可选地，所述预定的比例为：每5×106个间充质干细胞加入1ml细胞冻存液。可选地，所述预定降温程序为：依次在4℃下降温30分钟；-20℃下降温2小时；-80℃下降温16至18小时。可选地，所述将所述第二细胞悬液分装至若干根冻存管并封口，具体包括：向每根冻存管中装入1ml的第二细胞悬液。可选地，所述按照预定的比例，向所述间充质干细胞依次加入A液和B液并充分混匀后，获得第二细胞悬液，具体包括：对收集的间充质干细胞进行细胞计数；向5×106间充质干细胞中，加入0.5ml的A液并充分混匀；继续加入0.5ml的B液并充分混匀，获得所述第二细胞悬液。可选地，所述收集间充质干细胞，具体包括：待传代培养后的间充质干细胞的细胞融合度达70－80％时，加入胰蛋白酶消化液进行细胞消化；静置消化3分钟后，加入生理盐水停止消化，并收集第二细胞悬液；将所述第二细胞悬液进行离心，收集获得所述间充质干细胞。本专利技术实施例提供的冻存液，分为搭配使用的A液和B液，通过这样的方式，可以减少吹打混匀细胞的次数并且缩短二甲基亚砜与细胞的接触时间，降低其对于细胞的毒性，从而有效的提高细胞冻存后，细胞复苏时的得率和存活率。附图说明一个或多个实施例通过与之对应的附图中的图片进行示例性说明，这些示例性说明并不构成对实施例的限定，附图中具有相同参考数字标号的元件表示为类似的元件，除非有特别申明，附图中的图不构成比例限制图1为本专利技术具体实施例的冻存液制备方法的方法流程图；图2为本专利技术具体实施例的冻存方法的方法流程图。具体实施方式为使本专利技术的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下参照附图并举实施例对本专利技术进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。本专利技术实施例中揭露的数值及其数值范围是近似值，而并非确定值。在误差或者实验条件允许的情况下，可以包括在误差范围内的所有值。本专利技术实施例中提供的数值范围用于表示在混合物中的组分的相对量以及其他方法实施例中列举的温度或者其他参数的范围。本专利技术实施例中表述的术语“冻存”是指通过程序性降温的方式，在超低温环境(通常为液氮)中保存细胞或者组织，确保细胞或者组织在保存过程中的生物活性或者繁殖能力不丧失。在冻存过程中，需要在冻存管中加入相应的冻存液以确保细胞或者组织在冻存过程中不受到损伤，在复苏后可以重新进行传代培养并保持生物特性不改变。如何配置合适的冻存液配方，用以保持相关的组织或者细胞是干细胞在组织工程学及再生医学中广泛应用的基础和前提。为了满足间充质干细胞的低温冻存需求，在本实施例中，可以应用本专利技术提供的冻存液，确保冻存过程中间充质干细胞的生物活性不会丧失，复苏后具有足够的细胞得率和活率。图1为本专利技术实施例提供的间充质干细胞冻存液的制备方法。如图1所示，所述制备方法包括如下步骤：110、按体积百分比计算，将70-80％的DMEM培养基、1-2％的PSG，20-30％的FBS以及0.1-0.3％的β-疏基乙醇混合均匀，制备A液。120、按体积百分比计算，将78-80％的DMEM培养基、1-2％PSG以及20％的DMSO混合均匀，制备B液。其中，PSG是指青霉素-链霉素双抗及谷氨酰胺的混合物，FBS是指胎牛血清，DMSO是二甲基亚砜。在本实施例中，该间充质干细胞由A液和B液两个独立的混合液组成。所述A液和B液需要配合使用，以发挥冻存液的效果。具体的，所述A液可以由78.8％的DMEM培养基、1％的PSG，20％的FBS以及0.2％的β-疏基乙醇混合均匀形成，所述B液可以由79％的DMEM培养基、1％PSG以及20％的DMSO混合均匀形成。在实际使用时，A液和B液1比1配合使用，从而确保DMSO在冻存液中的比例为10％(按体积比计算)。130、将所述A液和所述B液放置在4℃中保存备用。所述4℃的低温环境具体可以是由常规的冰箱所提供的，可以通过将所述A液和B液放置在冰箱中来完成本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种间充质干细胞冻存液，其特征在于，所述冻存液由配合使用的A液和B液组成；所述A液按照体积百分比计算，包括如下成分：

【技术特征摘要】
1.一种间充质干细胞冻存液，其特征在于，所述冻存液由配合使用的A液和B液组成；所述A液按照体积百分比计算，包括如下成分：所述B液按照体积百分比计算，包括如下成分：DMEM培养基78-80％PSG1-2％DMSO20％。2.根据权利要求1所述的间充质干细胞冻存液，其特征在于，所述A液按照体积百分比计算，包括如下成分：所述B液按照体积百分比计算，包括如下成分：DMEM培养基79％PSG1％DMSO20％。3.一种间充质干细胞冻存液的制备方法，其特征在于，按体积百分比计算，将70-80％的DMEM培养基、1-2％的PSG，20-30％的FBS以及0.1-0.3％的β-疏基乙醇混合均匀，制备A液；按体积百分比计算，将78-80％的DMEM培养基、1-2％PSG以及20％的DMSO混合均匀，制备B液：将所述A液和所述B液放置在4℃中保存备用。4.根据权利要求3所述的间充质干细胞冻存液的制备方法，其特征在于，按体积百分比计算，所述A液由如下成分混合均匀形成：78.8％的DMEM培养基、1％的PSG，20％的FBS以及0.2％的β-疏基乙醇；按体积百分比计算，所述B液由如下成分混合均匀形成：79％的DMEM培养基、1％PSG以及20％的DMSO。5.一种应用如权利要求1所述的间充质干细胞冻存液的细胞冻存方法，其特征在于，所述方法包括：收集间充质干细胞；按照预定的比例，先向所述间充质干细胞加入A液，将间充质干...

【专利技术属性】
技术研发人员：李伟波，杨志华，罗世杰，
申请(专利权)人：深圳华云生物科技发展有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44