一种修复PCBs污染土壤的转基因拟南芥制造技术

一种修复PCBs污染土壤的转基因拟南芥属生物修复及环保技术领域，本发明专利技术的亚克隆来自抗辐射不动杆菌的AlnA基因和土壤宏基因组BphC基因，通过共表达AlnA+BphC植物表达载体的构建、农杆菌介导的植物遗传转化、转基因阳性植株抗性筛选、转基因植株修复PCB 28污染土壤效能等研究，获得可向根际持续分泌乳化蛋白的转基因植株，在植物根际提升PCBs的生物可利用性，在植物内部增强PCBs的开环作用，进而强化PCBs的根际修复效果，具有提升PCBs污染土壤原位生物修复效能的潜力，本发明专利技术在降低污染物对生态系统的威胁和提升PCBs植物修复生态安全性方面，具有很好的应用前景。

A Genetically Modified Arabidopsis thaliana for Rehabilitation of PCBs Contaminated Soil

A transgenic Arabidopsis thaliana for remediation of PCBs-contaminated soil is a field of bioremediation and environmental protection technology. The subcloning of the Arabidopsis thaliana gene and soil macrogenome BphC gene from Acinetobacter radiation-resistant bacteria is carried out by co-expression of AlnA+BphC plant expression vector construction, plant genetic transformation mediated by Agrobacterium tumefaciens, resistance screening of transgenic plants, and remediation of PCB-28 contaminated soil by transgenic plants. Soil efficiency and other research, obtain transgenic plants that can continuously secrete emulsifying protein to the rhizosphere, enhance the bioavailability of PCBs in the rhizosphere, enhance the opening of PCBs in the plant interior, and further strengthen the rhizosphere remediation effect of PCBs, have the potential to enhance the in-situ bioremediation efficiency of PCBs contaminated soil. The present invention reduces the threat of pollutants to the ecosystem and improves PCBs the planting of PCBs. In terms of ecological safety of bioremediation, it has good application prospects.

【技术实现步骤摘要】
一种修复PCBs污染土壤的转基因拟南芥
本专利技术属生物修复及环境保护
，特别是利用转基因拟南芥修复PCBs污染的土壤。
技术介绍
(1)多氯联苯的危害多氯联苯(PolychlorinatedBiphenyls，PCBs)一类人工合成的环境异源物质，其特征为联苯环上的氢原子被1-10个氯原子所取代，理论上共有209种同系物。PCBs具有良好的热化学稳定性，抗氧化性和绝缘性，曾在全球范围内作为电容器的绝缘介质(如变压器油)被广泛应用。但由于微量PCBs就可对生物体产生致癌、致畸和致突变等作用，并且具有远距离迁移、生物富集及难降解性，PCBs已被《关于持久性有机污染物的斯德哥尔摩公约》列为12种持久性有机污染物(PersistentOrganicPollutants，POPs)之一。(2)PCBs污染土壤修复研究现状国内外对PCBs污染土壤的治理，可分为物理修复、化学修复和生物修复等。虽然物理和化学修复方法也在深入研究和改进，但是仍然存在着成本高、能耗高、工艺复杂、破坏土壤结构，易造成二次污染等问题。而生物修复(微生物修复、植物修复和植物-微生物联合修复)，因具有低成本、应用性强、对环境友好、并可最大程度保持土壤基本性质不变等特点，一直为国内外学术界所关注。但已有研究表明，大多数微生物只能降解低氯代PCBs，并且微生物活性容易受环境条件的影响，导致PCBs污染土壤微生物修复效能低，因此植物修复已经成为PCBs污染土壤生物修复领域的研究热点。(2)植物修复及其限制因素植物根际修复PCBs污染土壤，在盆栽和温室模拟试验研究中获得了较为理想的结果，但是在实际场地修复过程中，往往达不到预期效果，其原因主要包括：A.植物吸收土壤中PCBs后，生长发育受到抑制；主要原因之一在于植物体内缺乏类似细菌的能使联苯开环的2,3-二羟基联苯双加氧酶(BphC)。B.PCBs强烈吸附于土壤介质中，生物可利用性差；C.微生物中催化PCBs分解代谢的基因表达水平低，不能有效降解PCBs。(4)转基因植物修复近年来，已有研究证实应用转基因技术对修复植物进行遗传改造，能显著增强修复植物对PCBs的耐受、吸收和转化能力。研究表明细菌BphC基因转入烟草，能够减轻羟基化多氯联苯对烟草的毒害作用，并增强其代谢PCBs的能力。申请者在前期工作中，已成功将一个新BphC基因转入紫花苜蓿，其耐受性显著优于野生型苜蓿。然而PCBs的低水溶性和易与土壤中有机质吸附的特性，是限制其被微生物降解和植物代谢转化的关键因素。向土壤中施加表面活性剂可有效的增加PCBs在土壤水相的溶解度，提高其生物可利用性。常用的化学表面活性剂优点是成本低，但通常具有生物毒性，易造成环境二次污染。因此环境友好型的生物表面活性剂备受关注。目前报道具有增加PCBs水溶性的生物表面活性剂包括鼠李糖脂、Peudomonascepacia产生的生物乳化剂GL-K12、茶皂苷和乳化蛋白AlnA。Alasan是从不动杆菌中发现的一种主要由蛋白质构成并对原油具有乳化能力的新型生物表面活性剂，其含有16KD、31KD和45KD三种蛋白，分别命名为AlnC、AlnB、AlnA，其中AlnA是主要表面活性成分，乳化能力最强。研究发现AlnA是细菌蛋白OmpA类似物的前体，在信号肽的引导下可直接分泌到胞外。已研究证实AlnA能增加PCBs溶解性能，浓度为20μg/L时，就可将不同氯取代的PCBs晶体增溶1.87-6.12倍，其性能优于常用的表面活性剂吐温-80和β-环糊精。AlnA具有增溶PCBs的能力和胞外分泌特性提示我们，以转BphC苜蓿-BB11为受体，利用农杆菌介导的遗传转化方法，将AlnA基因转入其中，获得可向根际持续分泌乳化蛋白AlnA的转基因植株(共表达AlnA+BphC)，提高土壤中PCBs的生物可利用性，增加PCBs污染土壤生物修复效能，降低污染物对生态系统的威胁，提升PCBs植物修复生态安全性的潜力和实际应用价值。
技术实现思路
本专利技术的转基因拟南芥为共表达AlnA+BphC拟南芥。本专利技术的共表达AlnA+BphC拟南芥，乳化蛋白AlnA具有增加PCBs水中的溶解性，BphC酶具有2,3-二羟基联苯双加氧酶活性。本专利技术的转基因拟南芥能在修复PCBs污染土壤中得到应用。以修复植物为受体，采用农杆菌介导转化法，将AlnA基因和BphC基因转入受体植物，获得共表达AlnA+BphC的转基因植株，能增加土壤中PCBs的生物可利用性，为高效去除土壤中有机污染物提供新的植物修复技术体系，对有机物污染土壤原位植物修复技术的发展，具有积极的理论意义和实用价值。本专利技术具有如下优点：1.将可增强土壤中残留PCBs生物可利用性的乳化蛋白AlnA和催化苯环开环BphC酶在植物体内共表达，提高PCBs污染土壤的生物可利用性、植物吸收PCBs的效率和植物对PCBs的耐受性，进而提高植物对土壤中残留有机污染物的耐受性和去除效率。2.本专利技术的转基因拟南芥能显著提高对多氯联苯等难溶性有机污染土壤的修复效能。附图说明图1为共表达AlnA+BphC拟南芥AlnA基因PCR电泳图其中：M：DNAmaker，DL2000；1：pCAMBIA3300N+AlnA+BphC质粒；2-16：共表达AlnA+BphC拟南芥；17：野生型拟南芥；18：空白对照。图2为共表达AlnA+BphC拟南芥BphC基因PCR电泳图其中：M：DNAmaker，DL2000；1：pCAMBIA3300N+AlnA+BphC质粒；2-6：共表达AlnA+BphC拟南芥；7：野生型拟南芥；8：空白对照。图3为转基因拟南芥的Westernblot鉴定其中：1、2：共表达AlnA+BphC拟南芥；3、4：转BphC拟南芥；5、6：野生型拟南芥。图4为转基因拟南芥BphC酶活性其中：1-1～1-6：共表达SP1+AlnA+BphC拟南芥；2-1～2-7：共表达SP2+AlnA+BphC拟南芥；WT：野生型拟南芥(注：图中不同小写字母表示在p＜0.05水平差异显著)。图5为转基因拟南芥AlnA动态分泌规律图6为转基因拟南芥对PCB28的耐受性其中：A：转BphC拟南芥；B：共表达AlnA+BphC拟南芥；C：野生型拟南芥图7为转基因拟南芥体内PCB28的含量图8为培养液中PCB28的去除率图9为转基因拟南芥修复PCB28污染土壤其中：A：植株生长30天；B植株生长80天；a：野生型拟南芥；b：转BphC拟南芥；c：共表达AlnA+BphC拟南芥。图10为拟南芥体内PCB28的含量图11为土壤中PCB28的去除率图10和图11中：AlnA+BphC：共表达AlnA+BphC拟南芥；AlnA：转AlnA拟南芥；BphC：转BphC拟南芥；WT：野生型拟南芥(注：图中不同小写字母表示在p＜0.05水平差异显著)。具体实施方式实施例1：共表达AlnA+BphC植物筛选乳化蛋白AlnA的基因来源于抗辐射不动杆菌(Acinetobacterradioresistens)，研究表明乳化蛋白AlnA对不同数目氯取代的多氯联苯都具有增溶活性。2,3-二羟基加氧酶(BphC)基因来至于土壤宏基因组文库，2,3-二羟基加氧酶是植物缺少的能将羟基化联苯开环的关键酶。(1)本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种转基因拟南芥，其特征在于,所述的转基因拟南芥为共表达AlnA+BphC拟南芥。

【技术特征摘要】
1.一种转基因拟南芥，其特征在于,所述的转基因拟南芥为共表达AlnA+Bp...

【专利技术属性】
技术研发人员：任何军，王岩，刘金亮，杨茹，张玉芩，张若男，杨凤，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：发明
国别省市：吉林,22