一种芹菜小孢子愈伤分化再生植株的方法技术

本发明专利技术公开了一种芹菜小孢子愈伤分化再生植株的方法，属于蔬菜育种技术领域。本发明专利技术的技术流程包括先将芹菜小孢子愈伤组织进行干燥处理，使其部分失水，再按照特定的配方制备分化培养基，将愈伤组织接种到分化培养基上在适宜的条件下培养，分化出小苗后转接到壮苗生根培养基上培养获得再生小苗，再生小苗经过驯化移栽长成再生植株，然后进行染色体倍性鉴定。本发明专利技术在之前研究的基础上，建立了一套从芹菜小孢子愈伤组织经过器官分化、壮苗生根、驯化移栽获得单倍体和双单倍体植株的体系，为芹菜单倍体育种以及遗传图谱绘制研究、基因克隆和转基因等研究提供理想材料。

A METHOD FOR PLANT REGENERATION FROM MICROSPORE CALLUS DIFFERENTIATION OF Celery

The invention discloses a method for celery microspore callus differentiation and plant regeneration, which belongs to the technical field of vegetable breeding. The technological process of the invention includes drying celery microspore callus to make part of it dehydrated, preparing differentiation medium according to specific formula, inoculating the callus into differentiation medium and culturing under suitable conditions, then transferring the differentiated seedlings to strong seedling rooting medium to obtain regenerated seedlings, and domesticating and transplanting the regenerated seedlings into regenerated seedlings. The plants were then identified for chromosome ploidy. On the basis of previous studies, the present invention establishes a system for obtaining haploid and diploid plants from celery microspore callus through organ differentiation, strong seedling rooting, domestication and transplantation, and provides ideal materials for celery menu ploidy breeding, genetic mapping, gene cloning and transgenic research.

【技术实现步骤摘要】
一种芹菜小孢子愈伤分化再生植株的方法
本发涉及一种芹菜小孢子愈伤分化再生植株的方法，属于蔬菜培育

技术介绍
芹菜，属伞形科植物，原产地中海沿岸地区，汉代传入我国，距今已有2000多年栽培历史。芹菜富含蛋白质、碳水化合物、芹菜素、维生素、钙、磷、铁、钠等，叶茎中还含有芹菜苷、佛手苷内酯和挥发油等药效成分，具有增进食欲、健胃、防癌、降血压、降血脂、防治动脉粥样硬化的作用，对神经衰弱、月经失调、痛风、肌肉痉挛也有一定的辅助食疗作用。芹菜还是高纤维食物，经常使用可以刺激胃肠蠕动利于排便，并且芹菜经肠内消化作用会产生一种木质素或肠内脂的物质，这类物质是一种抗氧化剂，可以起到美白皮肤、抗衰老的作用。中医认为，芹菜具有有平肝清热，祛风利湿，除烦消肿，凉血止血，解毒宣肺，健胃利血、清肠利便、润肺止咳、降低血压、健脑镇静的功效。随着人们生活水平的提高和保健意识的不断增强，芹菜越来越受到广大消费者的青睐。20世纪90年代以后，随着我国各地区农业结构调整，芹菜种植规模迅速扩大，特别是最近10年来，各地芹菜生产都得到稳步发展。目前，我国芹菜生产规模一直保持在55万hm2左右，高居世界首位。我国地域广阔，不同地区之间的气候条件、种植习惯和消费习惯差异明显，因此对芹菜品种的需求越来越丰富多样。随着芹菜种植面积扩大与种植茬次增多，重茬导致的病虫害日益严重，设施栽培时小气候条件的局限性与自然气候的异常变化更加重了病虫害发生程度。另一方面，我国对蔬菜安全生产控制越来越严格，对病虫害防治措施要求越来越规范，这些因素使得芹菜病虫害防治难度明显加大。可以预计，今后优质、高产、抗病型芹菜品种的推广速度将进一步加快，并且具有地方性特色的芹菜品种的市场占有量将会适当增加，而曾经在各地普遍推广的芹菜品种市场占有量将会进一步减少。在芹菜遗传育种与新品种选育方面，美国长期处于世界领先地位，例如在我国得到大面积种植的“文图拉”就是美国1983年推出的1个优良品种。而我国芹菜育种起步较晚，以往的主要研究工作集中在资源的收集、纯化利用，育种手段多局限于国外品种的引进、驯化和杂交选育。在十几年间，我国科研工作者也成功培育了10余个芹菜优良品种并投放市场，但杂交选育仍然存在着育种进程缓慢、育种年限很长且杂交后代会出现性状分离的问题。单倍体育种技术是一种生物技术育种手段，具有极早稳定分离后代、缩短育种年限、简化选育程序等优点。虽然单倍体育种技术早在几十年前就已经诞生，但是迄今为止，只有玉米、大白菜、油菜等少量植物具有成熟的单倍体育种技术。究其原因，单倍体育种技术与植物基因型密切相关。除基因型外，单倍体育种技术还要受到培养条件、培养基成分、激素种类和配比、其它处理方式等一系列因素的影响，这些影响因子彼此之间相对独立又相互联系，只有在所有影响因子都处于合适范围内，才有可能获得成功。获得单倍体的主要途径包括花药培养和小孢子培养。本研发团队在前期的研究工作中，已经成功摸索出了芹菜小孢子诱导培养基以及芹菜小孢子诱导出愈伤组织的方法，在此基础上，我们继续研究，建立了一套从芹菜小孢子愈伤组织经过器官分化、壮苗生根、驯化移栽获得单倍体和双单倍体植株的体系，为今后芹菜单倍体育种以及遗传图谱绘制研究、基因克隆和转基因等研究提供理想材料，对于加快芹菜育种进程具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种芹菜小孢子愈伤分化再生植株的方法，从而建立起芹菜小孢子培养获得再生植株的完整体系。本专利技术是通过以下技术方案实现的：一种芹菜小孢子愈伤分化再生植株的方法，其特征在于，该方法的技术流程如下：（1）愈伤组织干燥处理将芹菜小孢子诱导出的愈伤组织放到铺有3层无菌滤纸的培养皿中，置于23~25℃、黑暗的环境下干燥2~3d，使愈伤组织部分失水；（2）按照以下配方制备分化培养基大量元素：NH4NO3930~980mg/L，KNO31550~1750mg/L，KH2PO4104~110mg/L，K2HPO465~73mg/L，MgSO4·7H2O245~255mg/L，Ca（NO3）2204~212mg/L；微量元素：KI0.77~0.81mg/L，H3BO34.3~4.9mg/L，MnSO4·4H2O20~23mg/L，ZnSO4·7H2O8.5~9.0mg/L，Na2MoO4·2H2O0.21~0.25mg/L，CuSO4·5H2O15~18mg/L，CoCl2·6H2O0.02~0.03mg/L；铁盐络合物：甘氨酸铁28.6~30.2mg/L；常规有机成分：肌醇95~105mg/L，烟酸1.2~1.4mg/L，盐酸吡哆醇1.5~2.5mg/L，盐酸硫胺素6.6~7.0mg/L；碳源和凝固剂：纤维二糖12~15g/L，蔗糖22~26g/L，植物凝胶4~6g/L；额外添加成分：植物甲萘醌0.7~0.9mg/L，核黄素1.3~1.5mg/L，核苷酸3.3~3.7mg/L，左旋肉碱0.22~0.25mg/L，聚乙烯吡咯烷酮1.1~1.5mg/L，大豆卵磷脂2.5~2.7mg/L，硫酸镧0.06~0.1mg/L，N-亚硝基-N-乙基脲烷0.06~0.08mg/L，二硫苏糖醇13~17mg/L；植物提取液：黄芪提取液14~18mL/L，葛根提取液15~20mL/L；植物生长调节剂：6-BA2.8~3.2mg/L，2-（3，4-二氯苯氧基）三乙胺0.9~1.3mg/L，5-硝基愈创木酚钠0.3~0.5mg/L；制备好后将pH调节在5.6~6.0之间；（3）愈伤组织分化培养将干燥处理后的愈伤组织接种到上述分化培养基上进行变温培养，培养温度设定为光照时24~26℃，黑暗时20~22℃，光照时间为10~12h/d，黑暗时间为12~14h/d，光照采用绿光光源，强度为1500~2000Lx，每20d左右转入新鲜分化培养基作继代培养，30~40d后可见愈伤组织开始逐步分化，50~60d后可见萌动的不定芽或丛生小苗；（4）壮苗生根培养将长至2~3cm高、具3~4片真叶的小苗单株切下转接到壮苗生根培养基中，在培养温度23~27℃、光照时间14~16h/d、黑暗时间8~10h/d、光照强度2600~3000Lx的条件下，培养20~30d后可形成具有完整根系的再生小苗；（5）驯化移栽当再生小苗根系长至3~4cm长时，在培养室内开瓶炼苗1周，然后把小苗从培养瓶中取出，移入盛有基质的花钵中，扣上塑料袋保湿，给予自然光照，待小苗抽出新叶后将其移栽到大田中定植；（6）再生植株染色体倍性鉴定采用根尖染色法对移栽成活后的再生植株进行染色体倍性鉴定：选取1cm左右的幼嫩根尖，用0.002mol/L的8~羟基喹啉溶液处理3h，然后放入卡诺溶液（无水乙醇:冰醋酸=3:1）中处理24h，用蒸馏水清洗3次后放入酶解液中，在37℃水浴中酶解1h；然后将根尖放在载玻片上，用卡宝品红溶液染色，在显微镜下观察分析各再生植株的染色体倍性，与芹菜正常倍性植株进行比较。步骤（2）中所述分化培养基的优选配方如下：大量元素：NH4NO3955mg/L，KNO31650mg/L，KH2PO4107mg/L，K2HPO469mg/L，MgSO4·7H2O250mg/L，Ca（NO3）2208mg/L；微量元素：KI0.79mg/L，H3BO34.6本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种芹菜小孢子愈伤分化再生植株的方法，其特征在于，该方法的技术流程如下：（1）愈伤组织干燥处理将芹菜小孢子诱导出的愈伤组织放到铺有3层无菌滤纸的培养皿中，置于23~25℃、黑暗的环境下干燥 2~3d，使愈伤组织部分失水；（2）按照以下配方制备分化培养基大量元素：NH4NO3 930~980mg/L，KNO3 1550~1750mg/L，KH2PO4 104~110mg/L，K2HPO4 65~73mg/L，MgSO4·7H2O 245~255mg/L，Ca（NO3）2 204~212mg/L；微量元素：KI 0.77~0.81mg/L，H3BO3 4.3~4.9mg/L，MnSO4·4H2O 20~23mg/L，ZnSO4·7H2O 8.5~9.0mg/L，Na2MoO4·2H2O 0.21~0.25mg/L，CuSO4·5H2O 15~18mg/L，CoCl2·6H2O 0.02~0.03mg/L；铁盐络合物：甘氨酸铁28.6~30.2mg/L；常规有机成分：肌醇95~105mg/L，烟酸1.2~1.4mg/L，盐酸吡哆醇1.5~2.5mg/L，盐酸硫胺素6.6~7.0mg/L；碳源和凝固剂：纤维二糖12~15g/L，蔗糖22~26g/L，植物凝胶4~6g/L；额外添加成分：植物甲萘醌0.7~0.9mg/L，核黄素1.3~1.5mg/L，核苷酸3.3~3.7mg/L，左旋肉碱0.22~0.25mg/L，聚乙烯吡咯烷酮1.1~1.5mg/L，大豆卵磷脂2.5~2.7mg/L，硫酸镧0.06~0.1mg/L，N‑亚硝基‑N‑乙基脲烷0.06~0.08mg/L，二硫苏糖醇13~17mg/L；植物提取液：黄芪提取液14~18mL/L，葛根提取液15~20mL/L；植物生长调节剂：6‑BA 2.8~3.2 mg/L，2‑（3，4‑二氯苯氧基）三乙胺0.9~1.3mg/L，5‑硝基愈创木酚钠 0.3~0.5mg/L；制备好后将pH调节在5.6~6.0之间；（3）愈伤组织分化培养将干燥处理后的愈伤组织接种到上述分化培养基上进行变温培养，培养温度设定为光照时24~26℃，黑暗时20~22℃，光照时间为10~12h/d，黑暗时间为12~14h/d，光照采用绿光光源，强度为1500~2000Lx，每20d左右转入新鲜分化培养基作继代培养，30~40d后可见愈伤组织开始逐步分化，50~60d后可见萌动的不定芽或丛生小苗；（4）壮苗生根培养将长至2~3cm高、具3~4片真叶的小苗单株切下转接到壮苗生根培养基中，在培养温度23~27℃、光照时间14~16h/d、黑暗时间8~10h/d、光照强度2600~3000Lx的条件下，培养20~30d后可形成具有完整根系的再生小苗；（5）驯化移栽当再生小苗根系长至3~4cm长时，在培养室内开瓶炼苗1周，然后把小苗从培养瓶中取出，移入盛有基质的花钵中，扣上塑料袋保湿，给予自然光照，待小苗抽出新叶后将其移栽到大田中定植；（6）再生植株染色体倍性鉴定采用根尖染色法对移栽成活后的再生植株进行染色体倍性鉴定：选取1cm左右的幼嫩根尖，用0.002 mol/L的8~羟基喹啉溶液处理3h，然后放入卡诺溶液（无水乙醇:冰醋酸=3:1）中处理24h，用蒸馏水清洗3次后放入酶解液中，在37℃水浴中酶解1h；然后将根尖放在载玻片上，用卡宝品红溶液染色，在显微镜下观察分析各再生植株的染色体倍性，与芹菜正常倍性植株进行比较。...

【技术特征摘要】
1.一种芹菜小孢子愈伤分化再生植株的方法，其特征在于，该方法的技术流程如下：（1）愈伤组织干燥处理将芹菜小孢子诱导出的愈伤组织放到铺有3层无菌滤纸的培养皿中，置于23~25℃、黑暗的环境下干燥2~3d，使愈伤组织部分失水；（2）按照以下配方制备分化培养基大量元素：NH4NO3930~980mg/L，KNO31550~1750mg/L，KH2PO4104~110mg/L，K2HPO465~73mg/L，MgSO4·7H2O245~255mg/L，Ca（NO3）2204~212mg/L；微量元素：KI0.77~0.81mg/L，H3BO34.3~4.9mg/L，MnSO4·4H2O20~23mg/L，ZnSO4·7H2O8.5~9.0mg/L，Na2MoO4·2H2O0.21~0.25mg/L，CuSO4·5H2O15~18mg/L，CoCl2·6H2O0.02~0.03mg/L；铁盐络合物：甘氨酸铁28.6~30.2mg/L；常规有机成分：肌醇95~105mg/L，烟酸1.2~1.4mg/L，盐酸吡哆醇1.5~2.5mg/L，盐酸硫胺素6.6~7.0mg/L；碳源和凝固剂：纤维二糖12~15g/L，蔗糖22~26g/L，植物凝胶4~6g/L；额外添加成分：植物甲萘醌0.7~0.9mg/L，核黄素1.3~1.5mg/L，核苷酸3.3~3.7mg/L，左旋肉碱0.22~0.25mg/L，聚乙烯吡咯烷酮1.1~1.5mg/L，大豆卵磷脂2.5~2.7mg/L，硫酸镧0.06~0.1mg/L，N-亚硝基-N-乙基脲烷0.06~0.08mg/L，二硫苏糖醇13~17mg/L；植物提取液：黄芪提取液14~18mL/L，葛根提取液15~20mL/L；植物生长调节剂：6-BA2.8~3.2mg/L，2-（3，4-二氯苯氧基）三乙胺0.9~1.3mg/L，5-硝基愈创木酚钠0.3~0.5mg/L；制备好后将pH调节在5.6~6.0之间；（3）愈伤组织分化培养将干燥处理后的愈伤组织接种到上述分化培养基上进行变温培养，培养温度设定为光照时24~26℃，黑暗时20~22℃，光照时间为10~12h/d，黑暗时间为12~14h/d，光照采用绿光光源，强度为1500~2000Lx，每20d左右转入新鲜分化培养基作继代培养，30~40d后可见愈伤组织开始逐步分化，50~60d后可见萌动的不定芽或丛生小苗；（4）壮苗生根培养将长至2~3cm高、具3~4片真叶的小苗单株切下转接到壮苗生根培养基中，在培养温度23~27℃、光照时间14~16h/d、黑暗时间8~10h/d、光照强度2600~3000Lx的条件下，培养20~30d后可形成具有完整根系的再生小苗；（5）驯化移栽当再生小苗根系长至3~4cm长时，在培养室内开瓶炼苗1周，然后把小苗从培养瓶中取出，移入盛有基质的花钵中，扣上塑料袋保湿，给予自然光照，待小苗抽出新叶后将其移栽到大田中定植；（6）再生植株染色体倍性鉴定采用根尖染色法对移栽成活后的再生植株进行染色体倍性鉴定：选取1cm左右的幼嫩根尖，用0.002mol/L的8~羟基喹啉溶液处理3h，然后放入卡诺...

【专利技术属性】
技术研发人员：鲍樱文，杨鑫，
申请(专利权)人：江苏润知农业技术服务有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32