绣线菊超低温保存培养方法技术

本发明专利技术公开了一种绣线菊超低温保存培养方法，室温下将培养在预培养液中的长度为1‑2mm的绣线菊茎尖置于摇床振荡器中避光黑暗培养1‑3d后，用装载液处理20‑60min，取出绣线菊茎尖转入温度为0℃的玻璃化溶液中脱水30‑50min后放入冻存管中，再将冻存管存于液氮中进行超低温保存。本发明专利技术培养的绣线菊的复苏率和再生率均很高，为濒危的绣线菊种质资源保存提供了技术保证，将对蔷薇科、绣线菊亚科、绣线菊属植物资源的保存以及利用植物多样性来培育新品种提供一条有效途径。

Cryopreservation and Culture of Spiraea

The invention discloses an ultra-low temperature preservation and cultivation method for Spiraea chrysanthemum. The stem tips of Spiraea chrysanthemum cultured in the pre-culture medium with a length of 1_2 mm are placed in shaker oscillator for 1_3 days, treated with loading solution for 20_60 minutes, dehydrated in vitrification solution at 0 C for 30_50 minutes, and then placed in freezing storage tube, and then stored in liquid nitrogen. Cryopreservation was carried out. The recovery rate and regeneration rate of the cultured Spiraea are very high, which provides a technical guarantee for the conservation of endangered Spiraea germplasm resources, and provides an effective way for the conservation of Rosaceae, Spiraea subfamily, Spiraea genus plant resources and the utilization of plant diversity to cultivate new varieties.

【技术实现步骤摘要】
绣线菊超低温保存培养方法
本专利技术涉及种质资源保存
，具体是一种绣线菊超低温保存培养方法。
技术介绍
绣线菊(Asparagusofficinalis)为百合科天门冬属多年生草本植物，又名芦笋、龙须菜等，其味微甘，性平，具有清热利湿、活血散结等功效。据文献报道，绣线菊中含有丰富的矿物质、氨基酸、芦笋皂苷、多糖和黄酮等类生物活性成分，具有抗氧化、抗肿瘤、抗真菌和降血脂的药理活性。绣线菊能清热利湿，活血散结，主治肝炎、银屑病、高脂血症、乳腺增生,另对淋巴肉瘤、膀胱癌、乳腺癌、皮肤癌等有一定疗效。超低温保存(Cryopreservation)是上世纪70年代发展起来的一项现代种质资源离体保存技术。通常在液氮中保存，被保存材料细胞内的物质代谢和生长活动几乎完全停止，处在相对稳定的生物学状态，达到长期保存种质的目的，超低温保存是目前唯一不需要连续继代的中长期保存方式。玻璃化法(Vitrification)超低温保存是将细胞或组织置于由一定比例的渗透性和非渗透性保护剂组成的玻璃化溶液中，使材料及其玻璃化溶液在足够快的降温速率下固化成非结晶的玻璃化态，并以这种玻璃态在低温下保存。绣线菊超低温保存技术在国内外尚未见报道。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。本专利技术还有一个目的是提供一种绣线菊超低温保存培养方法，绣线菊的复苏率和再生率均很高，为濒危的绣线菊种质资源保存提供了技术保证，将对蔷薇科、绣线菊亚科、绣线菊属植物资源的保存以及利用植物多样性来培育新品种提供一条有效途径。为了实现根据本专利技术的这些目的和其它优点，提供了一种绣线菊超低温保存培养方法，包括：室温下将培养在预培养液中的长度为1-2mm的绣线菊茎尖或者腋芽置于摇床振荡器中避光黑暗培养1-3d后，用装载液处理20-60min，取出绣线菊茎尖或者腋芽转入温度为0℃的玻璃化溶液中脱水30-50min后放入冻存管中，再将冻存管存于液氮中进行超低温保存。优选的是，还包括：将冻存管从液氮中取出，吸除玻璃化溶液，用卸载液洗涤绣线菊茎尖1-3次后，转入恢复培养基进行复苏培养。优选的是，在吸除玻璃化溶剂后，先将绣线菊茎尖或者腋芽置于35-45℃的水浴中浸泡1-5min，再用卸载液洗涤绣线菊茎尖或者腋芽1-3次后，又用无菌水清洗绣线菊茎尖或者腋芽的表面，最后转入恢复培养基进行复苏培养。优选的是，预培养液为MS培养液，其包括质量分数为5％的DMSO、1.0mg/mL的6-BA、0.5mg/mL的NAA。优选的是，装载液包括以下成分：MS、2mol/L的丙三醇、0.4mol/L的蔗糖。优选的是，玻璃化溶液包括：MS、质量分数为30％的丙三醇、质量分数为15％的DMSO、质量分数为15％的乙二醇、0.4mol/L的蔗糖。优选的是，卸载液包括：MS、1.0mol/L的蔗糖；恢复培养基包括：1/2MS、1.0mg/L的6-BA、0.5mg/mL的NAA。优选的是，复苏培养时先在黑暗条件下培养3d，然后转入光照培养7d，光照时间为12h/d，光照强度为1800lux，温度为25℃，湿度为40％。优选的是，脱水时在脱水装置中进行，所述脱水装置包括用于容纳0℃的玻璃化溶液的第一容器和用于容纳绣线菊茎尖或者腋芽的第二容器，其中，所述第一容器为顶部敞开的长方体形壳体，所述第一容器水平放置，所述第一容器的内部卡设凹面朝上的弧形隔板，所述弧形隔板的两条线性边分别与所述第一容器顶部的宽边密封以将所述第一容器分隔为位于上方的弧形槽和位于下方的密闭空腔，所述密闭空腔内填充超细玻璃棉；所述第二容器包括支架、转轴、连接杆、容纳壳，所述支架位于所述第一容器外侧，所述转轴可转动的水平设置在所述支架上，所述转轴通过电机驱动，所述连接杆的一端固接在所述转轴上、另一端与所述容纳壳的顶部固接，所述容纳壳为底部具有进样口的球体结构，所述容纳壳上间隔设有四个进液孔，其中两个进液孔靠近所述容纳壳的顶部并关于所述转轴对称，剩余两个进液孔靠近所述进样口并关于所述转轴对称，所述容纳壳的内壁上贴附海绵，所述海绵不遮挡四个进液孔，所述容纳壳不与所述弧形隔板接触，所述进样口可拆卸地设有盖体，所述盖体上固设固定柱，所述固定柱的顶端固设顶部敞开的载物筒，所述固定柱和所述载物筒均位于所述容纳壳内，所述载物筒的顶部顶抵所述容纳壳内的海绵，所述载物筒的侧壁上间隔设有多个通孔，任意一个通孔的轴线均与任意一个进液孔的轴线垂直；当所述容纳壳位于所述弧形槽的正中央时，所述连接杆、所述载物筒、所述固定柱在竖直方向同轴设置，其中，所述弧形槽内盛装0℃的玻璃化溶液，所述载物筒内容纳绣线菊茎尖或者腋芽，所述弧形槽内盛装的0℃的玻璃化溶液浸没所述容纳壳，当0℃的玻璃化溶液通过四个进液孔、多个通孔充满所述载物筒后，所述电机控制所述转轴先顺时针转动四分之一圈，再逆时针转动四分之一圈，以使所述容纳壳在弧形槽内摆动直到脱水结束，且所述容纳壳始终浸没在玻璃化溶液中。优选的是，绣线菊茎尖或者腋芽在放入预培养液之前进行了预处理，预处理包括：将绣线菊茎尖或者腋芽放入1.2mol/L的甘氨酸中浸泡30s，然后埋入盛满琼脂的透明玻璃杯中，采用白炽灯照射，照射时以白炽灯为中心、距离白炽灯10cm为半径旋转透明装置，先顺时针旋转30s，再逆时针旋转30s，透明装置旋转所在的平面正对白炽灯，其中，透明玻璃杯是直径和高度均为1cm的圆柱体，绣线菊茎尖或者腋芽埋入琼脂后处于透明玻璃杯的中心点处，白炽灯的色温为2500K。本专利技术至少包括以下有益效果：本专利技术的方法具有操作简便，成本低，适宜保存种类广泛，保存材料遗传性稳定等优点，是近十年来用于优良种质资源中长期保存的首选方法。本专利技术提供一种绣线菊超低温保存培养方法，为濒危的绣线菊种质资源保存提供了技术保证，将对蔷薇科、绣线菊亚科、绣线菊属植物资源的保存以及利用植物多样性来培育新品种提供一条有效途径。本专利技术的超低温保存方法进行培养的绣线菊茎尖的复苏率均高于94％，再生率均高于90％，与直接从绣线菊植株上切取的茎尖进行培养的复苏率和再生率相差无几。尤其是本专利技术将绣线菊茎尖在脱水处理时采用了脱水装置，防止脱水时绣线菊茎尖内部形成晶核，促进绣线菊茎尖形成均匀的玻璃化状态，利于后续在液氮中保存，当从液氮中取出进行复苏培养时，复苏率和再生率高，比直接从绣线菊植株上切取的茎尖进行培养的发芽和成活情况还要好。本专利技术绣线菊茎尖在放入预培养液之前进行了预处理，通过预处理激活了绣线菊茎尖内的活性物质，整体细胞内各物质处于均匀的动态状态，在预培养之前，使得绣线菊茎尖具有良好的活性能力，经过预培养后，利于充分脱水，最终使绣线菊茎尖的复苏率和再生率提高。本专利技术的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本专利技术的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。附图说明图1为本专利技术的其中一个实施例中所述脱水装置的结构示意图。具体实施方式下面结合附图和实施例对本专利技术做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。需要说明的是，下述实施方案中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述试剂和材料，如本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.绣线菊超低温保存培养方法，其特征在于，室温下将培养在预培养液中的长度为1‑2mm的绣线菊茎尖或者腋芽置于摇床振荡器中避光黑暗培养1‑3d后，用装载液处理20‑60min，取出绣线菊茎尖或者腋芽转入温度为0℃的玻璃化溶液中脱水30‑50min后放入冻存管中，再将冻存管存于液氮中进行超低温保存。

【技术特征摘要】
1.绣线菊超低温保存培养方法，其特征在于，室温下将培养在预培养液中的长度为1-2mm的绣线菊茎尖或者腋芽置于摇床振荡器中避光黑暗培养1-3d后，用装载液处理20-60min，取出绣线菊茎尖或者腋芽转入温度为0℃的玻璃化溶液中脱水30-50min后放入冻存管中，再将冻存管存于液氮中进行超低温保存。2.如权利要求1所述的绣线菊超低温保存培养方法，其特征在于，还包括：将冻存管从液氮中取出，吸除玻璃化溶液，用卸载液洗涤绣线菊茎尖或者腋芽1-3次后，转入恢复培养基进行复苏培养。3.如权利要求2所述的绣线菊超低温保存培养方法，其特征在于，在吸除玻璃化溶剂后，先将绣线菊茎尖或者腋芽置于35-45℃的水浴中浸泡1-5min，再用卸载液洗涤绣线菊茎尖或者腋芽1-3次后，又用无菌水清洗绣线菊茎尖或者腋芽的表面，最后转入恢复培养基进行复苏培养。4.如权利要求1所述的绣线菊超低温保存培养方法，其特征在于，预培养液为MS培养液，其包括质量分数为5％的DMSO、1.0mg/mL的6-BA、0.5mg/mL的NAA。5.如权利要求1所述的绣线菊超低温保存培养方法，其特征在于，装载液包括以下成分：MS、2mol/L的丙三醇、0.4mol/L的蔗糖。6.如权利要求1所述的绣线菊超低温保存培养方法，其特征在于，玻璃化溶液包括：MS、质量分数为30％的丙三醇、质量分数为15％的DMSO、质量分数为15％的乙二醇、0.4mol/L的蔗糖。7.如权利要求2或3所述的绣线菊超低温保存培养方法，其特征在于，卸载液包括：MS、1.0mol/L的蔗糖；恢复培养基包括：1/2MS、1.0mg/L的6-BA、0.5mg/mL的NAA。8.如权利要求2或3所述的绣线菊超低温保存培养方法，其特征在于，复苏培养时先在黑暗条件下培养3d，然后转入光照培养7d，光照时间为12h/d，光照强度为1800lux，温度为25℃，湿度为40％。9.如权利要求1所述的绣线菊超低温保存培养方法，其特征在于，脱水时在脱水装置中进行，所述脱水装置包括用于容纳0℃的玻璃化溶液的第一容器和用于容纳绣线菊茎尖或者腋芽的第二容器，其中，所述第一容器为顶部敞开的长方体形壳体，所述第一容...

【专利技术属性】
技术研发人员：李翠，张占江，缪剑华，郭晓云，
申请(专利权)人：广西壮族自治区药用植物园，
类型：发明
国别省市：广西,45