一种草坪草种子组培外植体消毒的方法技术

技术编号:20910332 阅读:37 留言:0更新日期:2019-04-20 08:34
本发明专利技术涉及一种草坪草种子组培外植体消毒的方法,包括以下步骤:A、选取需进行愈伤组织诱导的草坪草种子,将其加入浓硫酸中进行振荡处理,去除颖壳;B、将去除颖壳的草坪草种子取出,置于水中,反复清洗残留的酸液;C、将经B处理后的草坪草种子进行灭菌处理,然后清洗得无菌草坪草种子。本发明专利技术采用浓硫酸把草坪草种子外的颖壳碳化掉,再用超纯水反复冲洗,大幅节省手工剥除或用砂布打磨去除种子颖壳的时间,且草坪草种子愈伤组织诱导的培养基基本达到零污染。

A Method of Disinfection of Tissue Culture Explants of Turfgrass Seeds

The invention relates to a method for disinfection of tissue culture explants of turf grass seeds, which includes the following steps: A. Selecting turf grass seeds that need callus induction, adding them to concentrated sulfuric acid for shaking treatment, removing glume shell; B. Taking turf grass seeds that remove glume shell, putting them in water, repeatedly cleaning residual acid solution; C. Sterilizing turf grass seeds treated by B. After treatment, sterile lawn grass seeds were washed. The invention uses concentrated sulfuric acid to carbonize the glume shell outside lawn grass seeds, and then rinses it repeatedly with ultra-pure water, which greatly saves the time of removing the glume shell by manual peeling or sanding, and basically achieves zero pollution of the culture medium for callus induction of lawn grass seeds.

【技术实现步骤摘要】
一种草坪草种子组培外植体消毒的方法
本专利技术涉及草坪草培育
,具体地说,涉及一种草坪草种子组培外植体消毒的方法。
技术介绍
草坪在城市园林绿化和国土绿化中占有重要的位置,对于平衡生态环境有很重要的意义。草坪不但可以美化环境,净化空气,调节小气候,降低噪音,保持水土和防止灾害等,而且还可以降低人的心理压力,消除疲劳,恢复体力。目前,为节约用水,降低草坪的养护费用,提高草坪的环境适应能力,培育耐寒、抗旱、耐盐碱、耐践踏等优良特性的草坪草新品种日益重要。随着生物技术的快速发展,特别是转基因在农业生产中的应用愈来愈成熟,为定向地培育草坪新品种提供了一条有效的途径。而草坪草植株再生体系的建立是生物技术(转基因)育种的基础,本专利技术以高羊茅种子为外植体,进行愈伤组织诱导。诱导愈伤组织的前提是去除种子外的颖壳,当前通常采用的技术方案是采用手工剥除或用砂纸打磨的方法去掉草坪种子外的颖壳,但是由于草坪种子个体很小、在去除颖壳时,不但极其费工费时,并且组培材料经常因附带少量的颖壳(导致外植体消毒不彻底)或种皮受损导致草坪种子在诱导愈伤组织时,培养基极易受到杂菌的污染,经反复验证污染率达到30%左右,极大的影响实验工作的顺利开展。
技术实现思路
针对现有技术的缺陷,本专利技术的目的是提供一种草坪草种子组培外植体消毒的方法。本专利技术的目的是通过以下技术方案实现的:本专利技术提供了一种草坪草种子组培外植体消毒的方法,包括以下步骤:A、选取需进行愈伤组织诱导的草坪草种子,将其加入浓硫酸中进行振荡处理,去除颖壳;B、将去除颖壳的草坪草种子取出,置于水中,反复清洗残留的酸液;C、将经B处理后的草坪草种子进行灭菌处理,然后清洗得无菌草坪草种子用于接种。优选地,步骤A中,所述浓硫酸与草坪草种子的体积比为1:1-1.5。若浓硫酸体积过高、草坪草种子体积过低,将导致草坪草种子碳化作用过重,伤害草坪种子,同时造成硫酸的浪费;若浓硫酸体积过低、草坪草种子体积过高,则会导致草坪种子外的颖壳不能彻底碳化,会影响进一步的灭菌效果。优选地,步骤A中,所述浓硫酸的质量浓度为1.6-1.84g/ml。若浓硫酸质量浓度过低,会导致草坪种子外的颖壳碳化不彻底,甚至失去对种子颖壳的碳化作用。优选地,步骤A中,所述振荡时间为10-15秒,振荡幅度15-20mm,振荡频率为80-100/min。振荡幅度过大,振荡频率过高,极易导致浓硫酸飞溅出容器,产生危险;振荡幅度过低,时间过长,易导致种子接触浓硫酸不均匀,结果不但造成种子颖壳去除不均匀,还容易造成部分种子因硫酸碳化作用受损。优选地,步骤B中,所述水的体积为浓硫酸体积的10-15倍。优选地,步骤B中,所述反复清洗的次数为5-6次。优选地,步骤C中,所述灭菌处理在超净工作台上进行;所述清洗采用高压灭菌处理过的无菌水。优选地,步骤C中,所述灭菌处理具体步骤如下:先将草坪草种子用酒精处理1.5-2min、然后用HgCl2处理8-10min。优选地,所述酒精的质量浓度为70-75%;HgCl2的质量浓度为0.1%。优选地,步骤C中,所述清洗次数为5-6次。经本专利技术的消毒方法处理后的无菌草坪草种子可接种到愈伤组织培养基,每个100ml三角瓶中接种10-15粒,放入培养室中,进行草坪种子愈伤组织的诱导。本专利技术利用浓硫酸脱水的原理,利用浓硫酸把草坪草种子外的颖壳碳化掉,然后用纯净水反复清洗种子表明残留的酸液,再结合普通的外植体消毒技术,达到草坪种子外植体快速有效消毒的目的,大幅度节省了手工去除种子颖壳或用砂纸打磨去除颖壳的时间,并且大幅减少了草坪种子愈伤组织诱导培养基的污染,促进了草坪草种子愈伤组织的成功诱导,为后期草坪草植株再生体系的建立,转基因工作的顺利开展奠定基础。与现有技术相比,本专利技术具有如下的有益效果:1.本专利技术采用浓硫酸把草坪种子外的颖壳碳化掉,再用无菌水反复冲洗,大幅节省人工去除种子颖壳的时间;2.草坪种子愈伤组织诱导的培养基基本达到零污染。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本专利技术,但不以任何形式限制本专利技术。应当指出的是,对本领域的普通技术人员来说,在不脱离本专利技术构思的前提下,还可以做出若干变形和改进。这些都属于本专利技术的保护范围。实施例1本实施例涉及一种草坪草种子组培外植体消毒的方法,包括以下步骤:1.实验材料的处理选择高羊茅草坪草种子,去除各种杂质及瘪的、不饱满的、畸形的草坪草种子。2.浓硫酸处理高羊茅草坪草种子颖壳按照浓硫酸和草坪草种子1:1的体积比例,取未经稀释的浓硫酸(质量浓度为1.84g/ml)至于1000ml的三角瓶中。注意为防止硫酸飞溅,硫酸的用量不宜超过瓶子容积的20%。3.再取经初步筛选过的草坪草种子,倒入三角瓶中,并立即开始振荡10-15秒,振荡幅度15-20mm,振荡频率为80-100/min。4.把振荡处理后的种子,迅速置于准备好的纯净水中,纯净水的量要达到硫酸体积的10-15倍,反复处理5-6次,结束浓硫酸对草坪草种子的碳化作用和彻底清除残留的硫酸,防止因继碳化脱水或者残留的酸液影响草坪种子愈伤组织的形成。5.在超净工作台中,对用浓硫酸去除颖壳并冲洗干净的草坪草种子用70%的酒精处理2min、然后用0.1%的升汞(HgCl2)10min灭菌,用无菌的蒸馏水清洗6次,然后将消毒后的无菌草坪草种子接种到愈伤组织培养基,每个100ml三角瓶中接种10-15粒,放入培养室中,进行草坪草种子愈伤组织的诱导,大幅降低草坪种子培养基的污染、成功获得了草坪草种子愈伤组织。本实施例方法的颖壳去除率为100%;进行草坪草种子愈伤组织的诱导培育时的污染率为零;草坪草种子愈伤组织的获得情况为:95%。实施例2本实施例涉及一种草坪草种子组培外植体消毒的方法,包括以下步骤:1.实验材料的处理选择早熟禾草坪草种子,去除各种杂质及瘪的、不饱满的、畸形的草坪草种子。2.浓硫酸处理早熟禾草坪草种子颖壳按照浓硫酸和草坪草种子1:1.3的体积比例,取浓硫酸(1.6g/ml)至于1000ml的三角瓶中。注意为防止硫酸飞溅,硫酸的用量不能超过瓶子容积的20%。3.再取经初步筛选过的草坪草种子,倒入三角瓶中,并立即开始振荡10-15秒,振荡幅度15-20mm,振荡频率为80-100/min。4.把振荡处理后的种子,迅速置于准备好的纯净水中,纯净水的量要达到硫酸体积的10-15倍,反复处理5-6次,以结束浓硫酸对草坪草种子的碳化作用和彻底清除残留的硫酸,防止因继碳化脱水或者残留的酸液影响草坪种子愈伤组织的形成。5.在超净工作台中,对用浓硫酸去除颖壳并冲洗干净的草坪草种子用70%的酒精处理2min、然后0.1%的升汞(HgCl2)10min灭菌,用无菌的蒸馏水清洗6次,然后将消毒后的无菌草坪草种子接种到愈伤组织培养基,每个100ml三角瓶中接种10-15粒,放入培养室中,进行草坪草种子愈伤组织的诱导,大幅降低草坪种子培养基的污染、成功获得了草坪草种子愈伤组织。本实施例方法的颖壳去除率为100%;进行草坪草种子愈伤组织的诱导培育时的污染率为零;草坪草种子愈伤组织的获得情况为:92%。实施例3本实施例涉及一种草坪草种子组培外植体消毒的方法,包括以下步骤:1.实验材料的处理选择剪股本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种草坪草种子组培外植体消毒的方法,其特征在于,包括以下步骤:A、选取需进行愈伤组织诱导的草坪草种子,将其加入浓硫酸中进行振荡处理,去除颖壳;B、将去除颖壳的草坪草种子取出,置于水中,反复清洗残留的酸液;C、将经B处理后的草坪草种子进行灭菌处理,然后清洗得无菌草坪草种子用于接种。

【技术特征摘要】
1.一种草坪草种子组培外植体消毒的方法,其特征在于,包括以下步骤:A、选取需进行愈伤组织诱导的草坪草种子,将其加入浓硫酸中进行振荡处理,去除颖壳;B、将去除颖壳的草坪草种子取出,置于水中,反复清洗残留的酸液;C、将经B处理后的草坪草种子进行灭菌处理,然后清洗得无菌草坪草种子用于接种。2.根据权利要求1所述的草坪草种子组培外植体消毒的方法,其特征在于,步骤A中,所述浓硫酸与草坪草种子的体积比为1:1-1.5。3.根据权利要求1所述的草坪草种子组培外植体消毒的方法,其特征在于,步骤A中,所述浓硫酸的质量浓度为1.6-1.84g/ml。4.根据权利要求1所述的草坪草种子组培外植体消毒的方法,其特征在于,步骤A中,所述振荡时间为10-15秒,振荡幅度15-20mm,振荡频率为80-100/min。5.根据权利要求1所述的草坪草种子组培外植体消...

【专利技术属性】
技术研发人员:刘松虎王志勇刘磊李蒙任毛飞夏维丽王磊鹏
申请(专利权)人:信阳农林学院
类型:发明
国别省市:河南,41

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