一种检测水稻条纹花叶病毒的基于免疫胶体金的斑点免疫印迹方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种检测水稻条纹花叶病毒(RSMV)的基于免疫胶体金的斑点免疫印迹方法及其应用。利用抗水稻条纹花叶病毒单克隆抗体1D4建立成快速灵敏、简单方便、准确高效地检测水稻和传毒介体电光叶蝉体内RSMV的基于免疫胶体金的斑点免疫印迹血清学检测技术，并开发成快速检测试剂盒。该斑点免疫印迹检测技术检测感染RSMV水稻病叶和携带RSMV电光叶蝉的灵敏度分别达到1:40960(w/v,g/mL)和1:5120倍稀释(单头/μL)。此简单快速、灵敏特异、准确高效的RSMV检测技术及其检测试剂盒为水稻条纹花叶病的快速诊断、抗病育种、预测预警及科学防控提供技术和物质支撑。

【技术实现步骤摘要】
一种检测水稻条纹花叶病毒的基于免疫胶体金的斑点免疫印迹方法及其应用
本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种检测水稻条纹花叶病毒的基于免疫胶体金的斑点免疫印迹方法及其应用。
技术介绍
水稻病毒病是水稻植物重要病害之一，每年对我国水稻产量造成了严重损失。2015年，在广东省罗定市田间发现了一种新的水稻病毒病害，它的症状不同于已报道各种水稻病毒病，其为弹状病毒科细胞质弹状病毒属一个新种，命名为水稻条纹花叶病毒(Ricestripemosaicvirus,RSMV)。就目前所知，该病毒是迄今为止唯一自然侵染水稻的细胞质弹状病毒，也是首个经电光叶蝉传播的细胞质弹状病毒。RSMV感染植株轻度矮缩，叶片呈条纹花叶状，且有部分病叶表现扭曲，病株可抽穗，但抽穗不完全且籽粒空瘪。3叶期稻苗经电光叶蝉传毒接种后10天，新叶出现明显黄色条纹，随后叶片表现为花叶，叶尖向内侧卷曲。RSMV病毒粒子呈杆状，在叶肉细胞及维管束系统细胞质中聚集并形成大量的晶格状，几乎充满整个细胞质空间，而细胞核内未观察到病毒粒子。有些病毒粒子聚集在囊泡内。在RSMV基因组的互补链上预测有7个ORFs，推测这7个ORFs的编码蛋白与多数弹状病毒的编码蛋白相似，ORF1预测编码病毒N蛋白；ORF2编码病毒的P蛋白；ORF3编码蛋白是一个碱性的膜蛋白，且该蛋白可能具有运动蛋白的功能；ORF4推测编码M蛋白；ORF5预测编码病毒G蛋白；ORF6推测编码一个辅助蛋白；ORF7预测编码病毒的L蛋白。RSMV的传播介体是电光叶蝉，其能以高效持久的方式传播RSMV。目前，根据症状观察判断田间水稻条纹花叶病毒的发生情况仍然是最主要的方法，但病毒侵染前期水稻没有任何症状，且多种病毒病造成的症状极为相似，另外，常有病毒复合侵染情况，因此依靠症状观察得到的结果缺乏准确性和科学性。电镜观察病毒粒子需要昂贵的仪器，且有些不同病毒粒子的大小和形态有相似性，导致其仅作为一种辅助检测手段。基于PCR方法的分子检测技术虽然灵敏，但是不适于大规模样品的检测，仅适合实验室对小样本的检测。而血清学方法简单易操作、快速、灵敏、成本较低，且适用于田间样品的大规模检测，是目前理想的植物病毒的检测技术。为此，本专利技术专利利用胶体金标记的申请人已申请专利申请号为201810134449.5的单抗1D4，成功建立检测该病毒的基于免疫胶体金的斑点免疫印迹检测技术及其检测试剂盒，从而为我国水稻条纹花叶病毒的检测诊断、预测预警、抗病育种及科学防控提供物质和技术支持。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服现有技术的不足，提供一种检测水稻条纹花叶病毒的基于免疫胶体金的斑点免疫印迹技术及其应用。一种检测水稻条纹花叶病毒的基于免疫胶体金的斑点免疫印迹方法，具体为：用胶体金标记抗水稻条纹花叶病毒的特异性单抗1D4作为检测抗体；所述的抗水稻条纹花叶病毒的特异性单抗1D4由杂交瘤细胞株分泌，该杂交瘤细胞株于2017年12月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.14898。其中，用胶体金标记抗体包括如下步骤：1)胶体金溶液制备：将100mL0.01％氯金酸加热至沸腾，加入1.2mL1％柠檬酸三钠后混匀，再保持沸腾30min后氯金酸还原成胶体金颗粒溶液；2)取50mL所述胶体金溶液，用0.1MK2CO3将其pH值调至8.2；3)调好pH值的胶体金溶液中边搅拌边加入2mLIgG浓度为2mg/mL的所述的特异性单抗1D4，搅拌30min；再逐滴加入1mL25M分子量为20000的聚乙二醇即PEG溶液，再搅拌15min；4)然后将3)中得到的混合液，于4℃20000rpm离心15min，弃上清液，加入10mLpH7.4且含0.4MPEG20000的0.01MPBS缓冲液悬浮，于4℃20000rpm离心15min，去上清获得沉淀；5)将沉淀重复用0.01MPBS缓冲液悬浮，离心；6)用10mLpH7.5且含2％BSA和0.02％叠氮化钠的PBS缓冲液溶解5)中得到的沉淀，用0.22μm无菌过滤器过滤后，滤液即为胶体金标记抗体溶液，4℃保存备用。其中，利用上述胶体金标记抗体溶液进行水稻条纹花叶病毒检测的方法具体包括如下步骤：1)硝酸纤维素(NC)膜准备：用铅笔在NC膜外层纸上划线，使NC膜印上方格线痕迹，每格规格0.3×0.3cm，平整放于干净的滤纸上；2)样品制备：a)植物样品的制备：将水稻或小麦植物组织称重后置于研钵中用液氮研磨成粉末，按0.1g植物组织加2mL的比例加入pH7.4的0.01MPBS后研钵中继续研磨匀浆1min，得到匀浆液；或者将水稻或小麦植物组织称重后按0.1g植物组织加2mL的比例加入0.01MPBS后于研钵中研磨匀浆2min，得到匀浆液；将匀浆液移至1.5mL离心管中，5000rpm离心3min，或静置5min，上清即为水稻或小麦植物组织的粗提液；b)传毒介体电光叶蝉样品的制备：一头电光叶蝉放入一个0.5ml的离心管中后加入50-100μL0.01MPBS，用牙签粗端或200μL枪头捣烂叶蝉呈匀浆液；3)点样：用移液器吸取水稻或小麦植物组织的粗提液以及电光叶蝉匀浆液各3μL，点样于NC膜的格子中央，室温下干燥10min；4)封闭：使用按5g脱脂奶粉加100mLPBST缓冲液的比例配制得到5％的脱脂奶粉封闭液，所述PBST缓冲液为含0.05％Tween-20的0.01mol/LPBS；NC膜在封闭液中室温下封闭0.5-1h；5)洗涤：去封闭液，用PBST缓冲液洗膜2次，每次3min；6)胶体金标记抗体孵育：NC膜放入用0.01mol/LPBS稀释2000倍的胶体金标记抗体溶液中，于水平摇床上缓慢摇动室温孵育1h；7)洗涤：去胶体金标记抗体溶液，用PBST缓冲液洗膜4-5次，每次3min；8)观察判断结果：出现红色斑点的样品为阳性，无色或绿色斑点的样品为阴性。上述方法检测感染RSMV水稻病叶灵敏度达到1:40960倍稀释，单位为w/v,g/mL，检测单头携带RSMV电光叶蝉的灵敏度达到1:5120倍稀释，单位为单头/μL；上述方法检测感染水稻条纹花叶病毒的水稻和电光叶蝉组织呈强阳性反应，而检测感染水稻条纹病毒、水稻黑条矮缩病毒、南方水稻黑条矮缩病毒、水稻锯齿矮缩病毒、水稻瘤矮病毒、水稻矮缩病毒以及健康水稻植物组织和非携毒电光叶蝉组织均呈阴性反应。本专利技术还提供了一种上述斑点免疫印迹方法的应用，其特征在于利用该方法或根据该方法设计的试剂盒，对田间水稻和传毒介体电光叶蝉的带毒情况进行检测诊断，确定水稻和电光叶蝉的带毒率，预测预警水稻条纹花叶病在田间的发生流行趋势。本专利技术与现有技术相比具有的有益效果：1)本专利技术提供一种检测水稻条纹花叶病毒的基于免疫胶体金的斑点免疫印迹方法及其检测试剂盒能高度特异、准确、灵敏地检测水稻条纹花叶病毒；2)利用本专利技术所提供一种检测水稻条纹花叶病毒的基于免疫胶体金的斑点免疫印迹方法，不需要昂贵的电子显微镜、PCR仪等设备；3)利用本专利技术提供的检测水稻条纹花叶病毒的基于免疫胶体金的斑点免疫印迹方法及其试剂盒，可有效地用于田间水稻及传毒介体电光叶蝉体内RSMV的检测和诊断，也可用于该病毒病的流行病学调查、病毒基因组功能分析、抗性育种、科学防控等方面；4)提供本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测水稻条纹花叶病毒的基于免疫胶体金的斑点免疫印迹方法，其特征在于用胶体金标记抗水稻条纹花叶病毒的特异性单抗1D4作为检测抗体；所述的抗水稻条纹花叶病毒的特异性单抗1D4由杂交瘤细胞株分泌，该杂交瘤细胞株于2017年12月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.14898。

【技术特征摘要】
1.一种检测水稻条纹花叶病毒的基于免疫胶体金的斑点免疫印迹方法，其特征在于用胶体金标记抗水稻条纹花叶病毒的特异性单抗1D4作为检测抗体；所述的抗水稻条纹花叶病毒的特异性单抗1D4由杂交瘤细胞株分泌，该杂交瘤细胞株于2017年12月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.14898。2.如权利要求1所述的检测水稻条纹花叶病毒的基于免疫胶体金的斑点免疫印迹方法，其特征在于用胶体金标记抗体包括如下步骤：1)胶体金溶液制备：将100mL0.01％氯金酸加热至沸腾，加入1.2mL1％柠檬酸三钠后混匀，再保持沸腾30min后氯金酸还原成胶体金颗粒溶液；2)取50mL所述胶体金溶液，用0.1MK2CO3将其pH值调至8.2；3)调好pH值的胶体金溶液中边搅拌边加入2mLIgG浓度为2mg/mL的所述的特异性单抗1D4，搅拌30min；再逐滴加入1mL25M分子量为20000的聚乙二醇即PEG溶液，再搅拌15min；4)然后将3)中得到的混合液，于4℃20000rpm离心15min，弃上清液，加入10mLpH7.4且含0.4MPEG20000的0.01MPBS缓冲液悬浮，于4℃20000rpm离心15min，去上清获得沉淀；5)将沉淀重复用0.01MPBS缓冲液悬浮，离心；6)用10mLpH7.5且含2％BSA和0.02％叠氮化钠的PBS缓冲液溶解5)中得到的沉淀，用0.22μm无菌过滤器过滤后，滤液即为胶体金标记抗体溶液，4℃保存备用。3.如权利要求2所述的检测水稻条纹花叶病毒的基于免疫胶体金的斑点免疫印迹方法，其特征在于利用所述胶体金标记抗体溶液进行水稻条纹花叶病毒检测的方法具体包括如下步骤：1)硝酸纤维素(NC)膜准备：用铅笔在NC膜外层纸上划线，使NC膜印上方格线痕迹，每格规格0.3×0.3cm，平整放于干净的滤纸上；2)样品制备：a)植物样品的制备：将水稻或小麦植物组织称重后置于研钵中用液氮研磨成粉末，按0.1g植物组织加2mL的比例加入pH7.4的0.01MPBS后研钵中继续研磨匀浆1min，得到匀浆液；或者将水稻或小麦植物组织称重后按...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴佳瑜，周雪平，洪健，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33