生物样品中虎杖苷及其代谢产物的检测方法技术

本发明专利技术公开了一种生物样品中虎杖苷及其代谢产物的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)对生物样品进行处理；和(2)采用超高效液相色谱‑质谱联用仪检测所述待测溶液。本发明专利技术的检测方法能够检测到生物样品中较多的虎杖苷代谢产物，从而为阐明虎杖苷的代谢途径奠定基础。

【技术实现步骤摘要】
生物样品中虎杖苷及其代谢产物的检测方法
本专利技术涉及生物样品中虎杖苷及其代谢产物的检测方法。
技术介绍
虎杖为蓼科植物虎杖PolygonumcuspidatumSieb.etZucc.的干燥根茎和根。从虎杖中分离出来的虎杖苷被认为是虎杖主要的一种天然活性成分，具有较强的生物活性。现代药理学研究表明，虎杖苷对心肌细胞、血管平滑肌细胞、抗血小板聚集、改善微循环等有显著作用,此外还能减轻多种因素造成的组织器官损伤，具有保护肝细胞，降血脂及抗脂质过氧化等作用，常被作为虎杖药材或虎杖苷复方制剂的质控指标。然而，目前，虎杖苷的体内代谢过程和代谢产物尚不明确。继续进一步研究。文献《LC-MS/MS测定大鼠血浆中虎杖苷浓度》(药学实践杂志，2012，30(1)，45-48)公开了测定大鼠血浆中虎杖苷浓度的LC-MS/MS方法，该方法采用二苯乙烯苷为内标，血浆样品用乙腈沉淀蛋白，流动相为甲醇-乙腈-0.1％甲酸水溶液，流速0.3ml/min，柱温30℃。该方法重点将血浆中的虎杖苷进行较好的分离，但没有考虑虎杖苷代谢产物的分离。文献《液相色谱-串联质谱法同时测定血浆中白藜芦醇苷及其代谢产物》(分析化学，2007年9月，35(9)，1309-1313)公开了采用液质联用检测并分离血浆中白藜芦醇苷及其代谢产物白藜芦醇的方法。流动相为乙腈和水，梯度洗脱方法为：0～2min，30vol％～60vol％乙腈；2～6min，60vol％～100vol％乙腈；6～14min，100vol％～30vol％乙腈，流速0.2ml/min，柱温30℃。该方法仅针对血浆中白藜芦醇苷及白藜芦醇进行分离分析，而不涉及白藜芦醇苷在体内大量代谢产物的分离。文献《大鼠肠道菌对虎杖苷的生物转化研究》(中国药学杂志，2012年4月，47(8)，631-634)中通过离体和整体实验观察了大鼠肠内菌对虎杖苷的代谢以及虎杖苷在大鼠胃肠道内的生物转化进行初步研究，并采用HPLC和LC-MS/MS技术对胃、肠容物及粪便中所含的虎杖苷以及白藜芦醇的含量进行测定。该方法的LC-MS方法采用流动相为0.02％氨溶液-乙腈，梯度洗脱。本方法同样仅研究虎杖苷及其代谢物白藜芦醇两种成分，代谢成分简单，不涉及白藜芦醇苷在体内大量代谢产物的分离。因此，需要一种全面检测虎杖苷代谢产物的检测方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是建立一种生物样品中虎杖苷及其代谢产物的检测方法，该方法能够较全面地检测虎杖苷的代谢产物。本专利技术的目的通过如下技术方案实现。一种生物样品中虎杖苷及其代谢产物的检测方法，包括如下步骤：(1)对生物样品进行处理：将C18固相萃取柱用1～3倍柱体积的甲醇进行活化，再用1～3倍柱体积的去离子水进行平衡，然后取0.2～2倍柱体积的生物样品加入所述固相萃取柱，依次以1～3倍柱体积的去离子水和0.5～2倍柱体积的甲醇洗脱，收集甲醇洗脱液，吹干，残渣用0.02～0.2倍柱体积的体积浓度为2vol％～7vol％的乙腈水溶液复溶，涡旋振荡，离心，取上清液作为待测溶液；其中，所述生物样品包括生物体吸收虎杖苷后的含有虎杖苷及其代谢产物的含药血浆样品和/或含药尿液样品；(2)采用超高效液相色谱-质谱联用仪检测所述待测溶液，其中：色谱条件为：色谱柱：C18色谱柱；流动相：0.1vol％甲酸水溶液A与乙腈B；柱温：40℃；梯度洗脱程序：0～2min，5vol％～20vol％B；2～15min，20vol％～54vol％B；流速：0.35mL/min；进样量：2μL；质谱条件为：电喷雾离子源负离子模式；鞘气流速：45arb；辅助气流速：25arb；毛细管电压：-35V；喷雾电压：3.5kV；管透镜电压：-110V；毛细管温度：325℃；傅里叶高分辨扫描范围m/z50～800；分辨率30000；二级和三级质谱采用数据依赖性扫描，选择上一级丰度最高的2个离子进行碰撞诱导解离碎片离子扫描；归一化碰撞能量：30～40％。根据本专利技术的检测方法，优选地，步骤(1)中，所述的生物样品还包括空白生物样品，其是指生物体正常饮食下的空白血浆样品和/或空白尿液样品。根据本专利技术的检测方法，优选地，步骤(1)中，涡旋振荡时间为2～10min，离心转速为10000～18000r/min，离心时间为8～20min。根据本专利技术的检测方法，优选地，步骤(1)中，所述生物样品的处理方法为：将C18固相萃取柱用1～2倍柱体积的甲醇进行活化，再用1～2倍柱体积的去离子水进行平衡，然后取0.2～0.6倍柱体积的生物样品加入所述固相萃取柱，依次以1～2倍柱体积的去离子水和0.6～1.5倍柱体积的甲醇洗脱，收集甲醇洗脱液，常温下氮气吹干，残渣用0.02～0.1倍柱体积的体积浓度为3vol％～5vol％的乙腈水溶液复溶，涡旋振荡3～4min，12000～14000r/min下离心12～15min，取上清液作为待测溶液。根据本专利技术的检测方法，优选地，步骤(1)中，将C18固相萃取柱用1.67倍柱体积的甲醇进行活化，再用1.67倍柱体积的去离子水进行平衡，然后取0.33倍柱体积的生物样品加入所述固相萃取柱，依次以1.67倍柱体积的去离子水和1倍柱体积的甲醇洗脱，收集甲醇洗脱液，常温下氮气吹干，残渣用0.03倍柱体积的体积浓度为5％的乙腈水溶液复溶，涡旋振荡3min，14000r/min下离心15min，取上清液作为待测溶液。根据本专利技术的检测方法，优选地，所述C18固相萃取柱为GracePureTMSPEC18-Low固相萃取小柱；所述色谱柱为ACQUITYUPLCBEHC18色谱柱。根据本专利技术的检测方法，优选地，步骤(2)中，所述归一化碰撞能量：33～39％。根据本专利技术的检测方法，优选地，步骤(2)中，所述归一化碰撞能量为37～38％。根据本专利技术的检测方法，优选地，所述检测方法还包括如下步骤：(3)对质谱数据进行数据处理：采用分子式预测模块，对质谱解离得到的母离子和碎片离子的分子式进行预测，相关参数设定为：C[0～30]，H[0～30]，O[0～20]，S[0～1]，环和不饱和键数[0～15]，质量精度误差在5ppm以内。根据本专利技术的检测方法，优选地，步骤(2)中，所述质谱仪为高分辨质谱仪。本专利技术的检测方法能够对生物样品中的虎杖苷及其众多代谢产物进行有效检测。根据本专利技术优选的实施方式，能够从含药血浆样品和含药尿液样品中检测到包括原型在内的41个虎杖苷代谢产物。本专利技术的检测方法为阐明虎杖苷的体内代谢机制奠定基础，并为进一步进行虎杖苷的体内药代动力学评价、药学研究、质量标准、工业化生产质控指标的制定以及临床方案的制定提供依据。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术作进一步的说明，但本专利技术的保护范围并不限于此。本专利技术提供一种生物样品中虎杖苷及其代谢产物的检测方法，包括如下步骤：(1)对生物样品的处理步骤，和(2)采用超高效液相色谱-质谱联用仪进行检测的步骤。任选地，包括(3)对质谱数据进行数据处理的步骤。＜生物样品的处理步骤＞本专利技术中，生物样品包括含药生物样品，含药生物样品是指生物体(例如人或动物)吸收虎杖苷后的含有虎杖苷及其代谢产物的含药血浆样品和/或含药尿液样品。本专利技术中，生物样品还可以包括空白生物样品，空白生物样品是指生物体(例如人或动物)正本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种生物样品中虎杖苷及其代谢产物的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)对生物样品进行处理：将C18固相萃取柱用1～3倍柱体积的甲醇进行活化，再用1～3倍柱体积的去离子水进行平衡，然后取0.2～2倍柱体积的生物样品加入所述固相萃取柱，依次以1～3倍柱体积的去离子水和0.5～2倍柱体积的甲醇洗脱，收集甲醇洗脱液，吹干，残渣用0.02～0.2倍柱体积的体积浓度为2vol％～7vol％的乙腈水溶液复溶，涡旋振荡，离心，取上清液作为待测溶液；其中，所述生物样品包括生物体吸收虎杖苷后的含有虎杖苷及其代谢产物的含药血浆样品和/或含药尿液样品；(2)采用超高效液相色谱‑质谱联用仪检测所述待测溶液，其中：色谱条件为：色谱柱：C18色谱柱；流动相：0.1vol％甲酸水溶液A与乙腈B；柱温：40℃；梯度洗脱程序：0～2min，5vol％～20vol％B；2～15min，20vol％～54vol％B；流速：0.35mL/min；进样量：2μL；质谱条件为：电喷雾离子源负离子模式；鞘气流速：45arb；辅助气流速：25arb；毛细管电压：‑35V；喷雾电压：3.5kV；管透镜电压：‑110V；毛细管温度：325℃；傅里叶高分辨扫描范围m/z 50～800；分辨率30000；二级和三级质谱采用数据依赖性扫描，选择上一级丰度最高的2个离子进行碰撞诱导解离碎片离子扫描；归一化碰撞能量：30～40％。...

【技术特征摘要】
1.一种生物样品中虎杖苷及其代谢产物的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)对生物样品进行处理：将C18固相萃取柱用1～3倍柱体积的甲醇进行活化，再用1～3倍柱体积的去离子水进行平衡，然后取0.2～2倍柱体积的生物样品加入所述固相萃取柱，依次以1～3倍柱体积的去离子水和0.5～2倍柱体积的甲醇洗脱，收集甲醇洗脱液，吹干，残渣用0.02～0.2倍柱体积的体积浓度为2vol％～7vol％的乙腈水溶液复溶，涡旋振荡，离心，取上清液作为待测溶液；其中，所述生物样品包括生物体吸收虎杖苷后的含有虎杖苷及其代谢产物的含药血浆样品和/或含药尿液样品；(2)采用超高效液相色谱-质谱联用仪检测所述待测溶液，其中：色谱条件为：色谱柱：C18色谱柱；流动相：0.1vol％甲酸水溶液A与乙腈B；柱温：40℃；梯度洗脱程序：0～2min，5vol％～20vol％B；2～15min，20vol％～54vol％B；流速：0.35mL/min；进样量：2μL；质谱条件为：电喷雾离子源负离子模式；鞘气流速：45arb；辅助气流速：25arb；毛细管电压：-35V；喷雾电压：3.5kV；管透镜电压：-110V；毛细管温度：325℃；傅里叶高分辨扫描范围m/z50～800；分辨率30000；二级和三级质谱采用数据依赖性扫描，选择上一级丰度最高的2个离子进行碰撞诱导解离碎片离子扫描；归一化碰撞能量：30～40％。2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的生物样品还包括空白生物样品，其是指生物体正常饮食下的空白血浆样品和/或空白尿液样品。3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，步骤(1)中，涡旋振荡时间为2～10min，离心转速为10000～18000r/min，离心时间为8～20min。4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，步骤(1)中，所述生物样品的处理方法为：将C18固相萃取柱用1～2倍...

【专利技术属性】
技术研发人员：张加余，梅晓丹，王喻淇，
申请(专利权)人：北京中医药大学，
类型：发明
国别省市：北京,11