本发明专利技术公开了一种可抛式核酸适配体传感器及其检测大田软海绵酸方法，属于水产品安全检测技术领域。本发明专利技术以大田软海绵酸的核酸适配体作为识别探针，将识别探针固定于丝网印刷金电极的工作电极表面，采用电化学阻抗谱进行测试，利用核酸适配体与OA结合前后工作电极表面电子传递阻抗值的变化量与OA浓度对数值之间的线性关系实现贝类中OA的定量检测。此传感器制备简单，方便快捷，成本低廉。采用此传感器进行贝类中OA的检测，方法简便、高效，检出限为1μg/kg，线性范围为1‑800μg/kg；回收率在91.95％‑118.56％范围内，相对标准偏差为5.21％～11.64％；可实现大批量样品的筛查与定量分析。
【技术实现步骤摘要】
一种可抛式核酸适配体传感器及其检测大田软海绵酸方法
本专利技术涉及一种可抛式核酸适配体传感器及其检测大田软海绵酸方法，具体是以核酸适配体作为识别探针，利用核壳型纳米金磁微粒(Fe3O4@Au)与核酸适配体5’端修饰的巯基的吸附作用将识别探针固定于丝网印刷金电极(Screen-printedgoldelectrode，SPGE)的工作电极表面，研制出一种可抛式核酸适配体传感器，实现了贝类中大田软海绵酸的快速、高灵敏检测。属于水产品安全检测
技术介绍
大田软海绵酸(Okadaicacid，OA)是腹泻性贝类毒素(Diarrheticshellfishpoisoning，DSP)的主要致毒组分，由利马原甲藻及部分鳍藻等产毒微藻产生，经双壳贝类滤食性摄入后富集在消化腺内。OA可引发误食者恶心、呕吐、腹泻；对细胞质内蛋白磷酸酶的活性有着强烈的抑制作用，影响正常的细胞活动；甚至对人类细胞具有直接的毒害作用，干扰DNA的修复过程，改变基因的表达，诱导肿瘤形成。为消除毒素对自身的毒害作用，贝类可通过复杂的生化反应将部分高毒性游离态的OA转化为形态各异的低毒性酯化态衍生物。此外，因OA具有脂溶性和热稳定性，在加工过程中很难通过常见的加工技术将其去除，甚至可能因贝类脱水及酯化态毒素向游离态的转化，从而导致毒素的毒性提高。为加强贝类安全的前端防控，国际食品法典委员会及欧盟规定双壳贝类可食性组织中DSP含量不得超过160μg/kg(以OA计)，为进一步降低食用风险，欧盟食品安全局根据风险评估结果拟将其降低至45μg/kg。我国NY5073-2006《无公害食品水产品中有毒有害物质限量》规定其不得检出。由于伦理道德等原因，欧盟指令(EC)No.15/2011规定小鼠生物法作为官方标准方法仅限于2014年底前使用，以液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)作为取代方法，并鼓励建立免疫分析等新型检测方法作为补充方法。
技术实现思路
本专利技术解决的技术问题是提供一种可抛式核酸适配体传感器及其检测大田软海绵酸方法，以提供一种简便快捷、绿色环保的技术手段，克服现有检测方法仪器昂贵、有机试剂用量大、操作难度大，难以实现现场、快速检测等缺陷。本专利技术以核酸适配体为识别探针，利用核壳型纳米金磁微粒(Fe3O4@Au)与核酸适配体5’端修饰的巯基的吸附作用将识别探针固定于丝网印刷金电极(Screen-printedgoldelectrode，SPGE)的工作电极表面，制备了一种可抛式核酸适配体传感器。以研制的传感器为检测手段，同时在贝类样品前处理过程中增加碱性水解步骤将OA的酯化态衍生物转化为游离态OA，实现了贝类体内OA总量的快速、高灵敏检测。本专利技术是通过以下技术方案实现的:一种可抛式核酸适配体传感器的制备方法，具体步骤如下：(1)SPGE的预处理：丝网印刷金电极，以下简称SPGE，使用前置于0.5mol/LH2SO4溶液中进行预处理，在0-1.25V电位范围内以0.1V/s速率采用循环伏安法(Cyclicvoltammetry，CV)扫描5min，以提高传感界面的粗糙度而利于其功能化修饰；(2)传感器的制备：将步骤(1)处理的SPGE用超纯水冲洗吹干后，在其工作电极背面对应处固定一圆形磁铁，在工作电极表面滴加10μL1mg/mLFe3O4@Au混悬液，待Fe3O4@Au固定后，滴加10μL5μmol/L核酸适配体溶液，置于湿盒中反应过夜；用超纯水冲洗后，在工作电极表面滴加10μL1mmol/LMCH溶液反应1h，以封闭多余的吸附位点即完成传感器的制备。本专利技术还提供利用所述可抛式核酸适配体传感器进行检测贝类中大田软海绵酸的方法，具体步骤如下(1)样品前处理：称取匀浆样品，用甲醇进行毒素提取，涡旋振荡2min，8000r/min离心5min，将上清液用甲醇定容；准确移取提取液，加入NaOH溶液混匀后密封进行高温水解；待溶液冷却至室温继续加入HCl溶液中和后氮吹近干，再加入缓冲溶液复溶，涡旋混匀，待测；(2)大田软海绵酸的测定：在传感器工作电极表面滴加OA标准溶液或样品溶液，反应结束后，用超纯水冲洗，然后在含终浓度5mmol/LK3[Fe(CN)6]、5mmol/LK4[Fe(CN)6]和0.1mol/LKCl的pH7.4、浓度10mmol/LPBS缓冲液中以频率范围0.1-10000Hz，振幅0.01V，初始电位0.23V进行电化学阻抗谱EIS测试，记录标准溶液或样品溶液反应前后的阻抗值以完成定量测定。进一步，所述步骤(1)提取液与NaOH溶液进行水解时的溶液体积比为1：1.25，水解条件为76℃下温育40min。进一步，所述步骤(1)加入的NaOH与加入的HCl物质的量相等。进一步，步骤(2)在传感器工作电极表面滴加OA标准溶液或样品溶液，反应时间为45min。本专利技术与现有技术相比的有益效果：(1)和基于抗原-抗体反应原理的免疫传感器相比，核酸适配体的合成和使用更加简单价廉，大幅降低传感器的制备成本。(2)通过引入核壳型纳米金磁微粒(Fe3O4@Au)改进传感器的组装过程，提高检测方法灵敏度的同时扩大了线性范围，检出限为0.1μg/L，比国标方法的检出限值降低一个数量级。应用于实际贝类样品检测时最低检出浓度为1μg/kg，定量范围为1-800μg/kg。(3)一次性可抛SPGE的使用，省去了传统电极繁杂的抛光过程，同时避免了因基质成分或待测物在电极表面的吸附而造成的电极污染、钝化或干扰现象。(4)样品前处理过程增加碱性水解步骤将OA的酯化态衍生物转化为游离态OA，实现了贝类体内OA总量的测定，有效避免贝类食用安全风险。(5)测试方法操作简单，仅通过电化学工作站采用EIS测试即可得到贝类中OA的定量结果，检测液不使用有机试剂，可作为一种新型、绿色的快速检测手段用于贝类样品中OA的日常监测，实现对贝类样品的快速筛查。附图说明图1为可抛式核酸适配体传感器制备过程及检测原理示意图。图2为经过不同修饰步骤的丝网印刷金电极的电化学阻抗谱Nyquist图(内插图为等效电路图)。图3为核酸适配体浓度对传感器阻抗变化量的影响。图4为OA反应时间对传感器阻抗变化量的影响。图5为OA浓度-阻抗变化量一元线性曲线。具体实施方式下面通过实施例对本专利技术的技术方案做进一步解释，但本专利技术的保护范围不受实施例任何形式上的限制。一种高灵敏检测贝类中大田软海绵酸的可抛式核酸适配体传感器及其检测方法，包括以下步骤:(1)样品前处理：称取2g匀浆样品，用18mL甲醇进行毒素提取，涡旋振荡2min，8000r/min离心5min，将上清液于20mL容量瓶中用甲醇定容。准确移取1mL提取液，加入125μL2.5mol/LNaOH溶液混匀后密封，于76℃下温育40min。待溶液冷却至室温继续加入125μL2.5mol/LHCl溶液中和后氮吹近干，再加入1mLPBS缓冲溶液复溶，涡旋混匀，待测。(2)SPGE的预处理：SPGE使用前置于0.5mol/LH2SO4溶液中进行预处理，在0-1.25V电位范围内以0.1V/s速率采用循环伏安法(Cyclicvoltammetry，CV)扫描5min，以提高传感界面的粗糙度而利于其功能化修饰。(3)传感器的制备：将SPGE用超纯水冲洗吹干本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种可抛式核酸适配体传感器的制备方法，其特征在于所述方法包括以下步骤:(1)电极的预处理：以丝网印刷金电极为基底电极，置于0.5mol/L H2SO4溶液中，在0‑1.25V电位范围内以0.1V/s速率采用循环伏安法扫描5min，丝网印刷金电极以下简称SPGE；(2)可抛式核酸适配体传感器的制备：将预处理后的SPGE用超纯水冲洗吹干后，在其工作电极背面对应处固定一直径为4mm的圆形磁铁，在工作电极表面滴加10μL纳米金磁微粒混悬液，待纳米金磁微粒固定后，滴加10μL核酸适配体溶液，置于湿盒中反应过夜；用超纯水冲洗后，在工作电极表面滴加10μL 6‑巯基‑1‑己醇溶液以封闭多余的吸附位点即完成传感器的制备，置于4℃下保存待用。
【技术特征摘要】
1.一种可抛式核酸适配体传感器的制备方法，其特征在于所述方法包括以下步骤:(1)电极的预处理：以丝网印刷金电极为基底电极，置于0.5mol/LH2SO4溶液中，在0-1.25V电位范围内以0.1V/s速率采用循环伏安法扫描5min，丝网印刷金电极以下简称SPGE；(2)可抛式核酸适配体传感器的制备：将预处理后的SPGE用超纯水冲洗吹干后，在其工作电极背面对应处固定一直径为4mm的圆形磁铁，在工作电极表面滴加10μL纳米金磁微粒混悬液，待纳米金磁微粒固定后，滴加10μL核酸适配体溶液，置于湿盒中反应过夜；用超纯水冲洗后，在工作电极表面滴加10μL6-巯基-1-己醇溶液以封闭多余的吸附位点即完成传感器的制备，置于4℃下保存待用。2.根据权利要求1所述的一种可抛式核酸适配体传感器的制备方法，其特征在于所述的纳米金磁微粒混悬液的制备方法是采用5mg/mL的30nmFe3O4@Au纳米金磁微粒，用pH7.4、浓度为10mmol/LPBS缓冲溶液进行清洗2次后稀释至浓度1mg/mL。3.根据权利要求1所述的一种可抛式核酸适配体传感器的制备方法，其特征在于所述的核酸适配体溶液由10mmol/L、pH7.4的PBS缓冲溶液配制，浓度为5μmol/L，所述的置于湿盒中反应过夜为14h。4.根据权利要求1所述的一种可抛式核酸适配体传感器的制备方法，其特征在于所述的6-巯基-1-己醇溶液由10mmol/L、pH7.4的PBS缓冲溶液配制，浓度为1mmol/L，所述的反应时间为1h。5.利...
【专利技术属性】
技术研发人员：郭萌萌，谭志军，陈佳琦，吴海燕，郑关超，彭吉星，翟毓秀，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院黄海水产研究所，
类型：发明
国别省市：山东,37
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