一种大麦籽粒β-葡聚糖提取物纯度快速测定的方法技术

本发明专利技术提供了一种大麦籽粒β‑葡聚糖提取物纯度快速测定的方法，包括β‑葡聚糖经苔聚糖酶水解成低聚糖后，经β‑葡萄糖苷酶再次水解成葡萄糖，加入显色液溶液水浴加热后，使用酶标仪测定葡萄糖510nm处值ΔA，根据葡萄糖浓度计算出β‑葡聚糖纯度。本发明专利技术方法操作简单、试剂使用量少、所使用仪器简便、提取时间短，具有较高的生产应用价值。适合实验室、质检中心以及功能食品加工厂等场合快速测定大麦籽粒β‑葡聚糖提取产物的纯度。

【技术实现步骤摘要】
一种大麦籽粒β-葡聚糖提取物纯度快速测定的方法
本专利技术涉及一种提取物纯度测定的方法，具体为一种大麦籽粒β-葡聚糖提取物纯度快速测定的方法。
技术介绍
大麦籽粒β-葡聚糖是一个重要的膳食纤维来源，具有非常好的营养保健功能，日益受到人们的重视。β-葡聚糖通过增加进入肠道的食物粘性和提高7α-羟化酶活性，从而降低对胆固醇和胆汁酸的吸收。每餐摄入一定量的β-葡聚糖，在餐后一段时间体内的血糖和胰岛素指数都呈明显下降；此外，β-葡聚糖还可降低一些严重疾病的发生，如：II型糖尿病、心血管疾病和结肠癌等。当前，大麦籽粒β-葡聚糖含量与纯度测定方法仍停留在原有的化学方法之上，测定过程烦琐，单次测定样品数量少，当待测定样品较多时效率极低。而这在很大程度上限制了大麦的营养食品研发以及专用型大麦新品种的遴选培育，需待改进。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的旨在提供一种大麦籽粒β-葡聚糖提取物纯度快速测定的方法，该方法具有操作简单、试剂使用量少、提取时间短的特点。为了实现上述技术目的，本专利技术具体通过以下技术方案实现：一种大麦籽粒β-葡聚糖提取物纯度快速测定的方法，测定原理为：β-葡聚糖经苔聚糖酶(Lichenase)水解成低聚糖后，经β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase)再次水解成葡萄糖；葡萄糖经葡萄糖氧化酶(GOD)氧化，产生葡萄糖酸和过氧化氢；过氧化氢又经辣根过氧化物酶(POD)作用，分解出氧，同时将无色的4-氨基安替比林和苯酚偶联氧化，并缩合成红色的醌亚胺；其色泽深浅在一定范围内与葡萄糖浓度成正比，通过酶标仪大量快速测定样品吸光值，根据葡萄糖浓度可计算出β-葡聚糖纯度。具体测定过程包括以下步骤：1)取β-葡聚糖提取物于缓冲液A中，70℃水浴充分溶解；2)加入苔聚糖酶溶液溶于缓冲液A，充分混匀水浴1h；3)加入缓冲液C混匀，在1000g条件下离心5min；4)取上清分别加入到3个干净的离心管中，其中两份加入β-葡糖苷酶溶液，另一份加入缓冲液B，水浴加热10min；5)加入显色液溶液水浴加热20min后，使用酶标仪测定510nm处值ΔA；6)根据葡萄糖浓度计算出β-葡聚糖纯度，计算公式如下：β-gluca(％w/w)＝ΔA×F×92×1/1000×100/W×162/180其中，ΔA为样品吸光值－空白吸光值，F为100/100μg葡萄糖吸光值，W为β-葡聚糖提取物样品重量。进一步的，所述的缓冲液A为：磷酸钠缓冲液，20mM，p6.5。进一步的，所述的缓冲液B为：醋酸钠缓冲液，50mM，pH4.0。进一步的，所述的缓冲液C为：醋酸钠缓冲液，200mM，pH4.0。进一步的，所述的显色液为将溶液A与溶液B以9:1混合得到，所述的溶液A为：取900mL缓冲液A，加入94mg苯酚，定容至1L，配制成10mmol/L的苯酚溶液；所述的溶液B为取90mL缓冲液A，称入277.78mg葡萄糖氧化酶、66.67mg辣根过氧化物酶、410mg4-氨基安替吡啉，混匀后定容到100mL。进一步的，步骤(2)、(4)和(5)中水浴加热的条件为40℃。本专利技术的有益效果为：本专利技术通过将β-葡聚糖提取物转化为葡萄糖，利用酶标仪测定葡萄糖的吸光值，从而计算出β-葡聚糖纯度，该方法操作简单、试剂使用量少、所使用仪器简便、提取时间短，具有较高的生产应用价值。适合实验室、质检中心以及功能食品加工厂等场合快速测定大麦籽粒β-葡聚糖提取产物的纯度。具体实施方式下面将结合本专利技术具体的实施例，对本专利技术技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。本实施例具体提供了一种大麦籽粒β-葡聚糖提取物纯度快速测定的方法，包括以下步骤：1、所需实际的配置缓冲液A(磷酸钠缓冲液，20mM，p6.5)：称取3.12g二水合磷酸二氢钠溶于900mL蒸馏水，用100mM(4g/L)的氢氧化钠调节pH到6.5后，定容到1L。在加入0.2g叠氮化钠的情况下可在4℃下保存两个月。缓冲液B(醋酸钠缓冲液，50mM，pH4.0)：在900mL蒸馏水中加入2.9mL冰醋酸，用1M的氢氧化钠调节pH到4.0后，定容到1L。在加入0.2g叠氮化钠的情况下可在4℃下保存两个月。缓冲液C(醋酸钠缓冲液，200mM，pH4.0)：在900mL蒸馏水中加入11.6mL冰醋酸，用1M的氢氧化钠调节pH到4.0后，定容到1L。在加入0.2g叠氮化钠的情况下可在4℃下保存两个月。溶液A：取900mL缓冲液A，加入94mg苯酚，定容至1L，配制成10mmol/L的苯酚溶液。在4℃下可保存14天。溶液B：取90mL缓冲液A，称入277.78mg葡萄糖氧化酶(冻干粉，180U/mg，G109029-50KU，阿拉丁)、66.67mg辣根过氧化物酶(冻干粉，150U/mg，77332-100MG，SIGMA)、410mg4-氨基安替吡啉，混匀后定容到100mL。在4℃下可保存14天。显色液：将溶液A与溶液B以9:1混合，其中葡萄糖氧化酶16000U/L，辣根过氧化物酶1000U/L，4-氨基安替吡啉2.0mmol/L。室温下可保存24小时。2、所需仪器、设备离心管和试管架、移液枪、酶标仪、恒温水浴箱、酶标板、涡旋振荡器。3、F值测定1)称取D-葡萄糖(D-glucose)0.05g溶解后定容到100mL，浓度为500μg/mL；2)吸取0.2mLD-葡萄糖溶液至酶标板中，510nm测定吸光值；3)F＝100/吸光值。4、测定步骤1)精确称取10mgβ-葡聚糖提取物于10mL离心管中，加入4mL缓冲液A(磷酸钠缓冲液，20mM，pH6.5)，70℃水浴充分溶解；2)加入0.2mL苔聚糖酶溶液(Lichenase,10U，溶于缓冲液A)，混匀后40℃水浴1h，期间震荡多次；3)加入5mL缓冲液C(醋酸钠缓冲液，200mM，pH4.0)混匀；4)1000g，离心5min；5)取4)中上清0.1mL分别加入到3个干净的10mL离心管中；6)其中两份加入0.1mLβ-葡糖苷酶溶液(β-glucosidase，0.2U，溶于缓冲液C)，另一份加入0.1mL缓冲液B，40℃水浴10min；7)加入3.0mL显色液溶液，40℃水浴20min；8)吸取0.2mL到酶标板中，使用酶标仪测定510nm处值ΔA。每批次测定时均需同时加入标准样品与葡萄糖标准样(100μg)的测定。5、纯度计算β-gluca(％w/w)＝ΔA×F×92×1/1000×100/W×162/180ΔA＝样品吸光值－空白吸光值；F＝100/100μg葡萄糖吸光值；92＝测定体系体积换算，从9.2mL中取出0.1mL；1/1000＝μg与mg单位换算；100/W＝β-葡聚糖质量分数(纯度)；W＝β-葡聚糖提取物样品重量(mg)；162/180＝β-葡聚糖分子内葡糖酐含量与自由D-葡萄糖分子的换算系数。尽管已经示出和描述了本专利技术的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本专利技术的原理和精神的情况下可以对这些实例进行多种变化、修改、替换和变型，本专利技术的范围由所附权利要求及其等同物限定。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种大麦籽粒β‑葡聚糖提取物纯度快速测定的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)取β‑葡聚糖提取物于缓冲液A中，70℃水浴充分溶解；2)加入苔聚糖酶溶液溶于缓冲液A，充分混匀水浴1h；3)加入缓冲液C混匀，在1000g条件下离心5min；4)取上清分别加入到3个干净的离心管中，其中两份加入β‑葡糖苷酶溶液，另一份加入缓冲液B，水浴加热10min；5)加入显色液溶液水浴加热20min后，使用酶标仪测定510nm处值ΔA；6)根据葡萄糖浓度计算出β‑葡聚糖纯度，计算公式如下：β‑gluca(％w/w)＝ΔA×F×92×1/1000×100/W×162/180其中，ΔA为样品吸光值－空白吸光值，F为100/100μg葡萄糖吸光值，W为β‑葡聚糖提取物样品重量。

【技术特征摘要】
1.一种大麦籽粒β-葡聚糖提取物纯度快速测定的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)取β-葡聚糖提取物于缓冲液A中，70℃水浴充分溶解；2)加入苔聚糖酶溶液溶于缓冲液A，充分混匀水浴1h；3)加入缓冲液C混匀，在1000g条件下离心5min；4)取上清分别加入到3个干净的离心管中，其中两份加入β-葡糖苷酶溶液，另一份加入缓冲液B，水浴加热10min；5)加入显色液溶液水浴加热20min后，使用酶标仪测定510nm处值ΔA；6)根据葡萄糖浓度计算出β-葡聚糖纯度，计算公式如下：β-gluca(％w/w)＝ΔA×F×92×1/1000×100/W×162/180其中，ΔA为样品吸光值－空白吸光值，F为100/100μg葡萄糖吸光值，W为β-葡聚糖提取物样品重量。2.根据权利要求1所述的β-葡聚糖提取物纯度快速测定的方法，其特征在于，所述的缓冲液A为：磷酸钠缓冲液，...

【专利技术属性】
技术研发人员：巫小建，汪军妹，杨建明，华为，朱靖环，尚毅，
申请(专利权)人：浙江省农业科学院，
类型：发明
国别省市：浙江,33