一种外泌体表面蛋白检测方法技术

技术编号:20901559 阅读:95 留言:0更新日期:2019-04-17 16:28
本发明专利技术公开一种外泌体表面蛋白检测方法,包括如下步骤:第一步,利用离心法提取肿瘤细胞培养基中的外泌体;第二步,利用报告探针和待测外泌体进行反应,所述的报告探针为球形金纳米粒子,表面连接蛋白适配体和拉曼分子;第三步,观察报告探针的颜色或检测报告探针的SERS信号。本发明专利技术将比色法和SERS检测技术同时运用到外泌体表面蛋白检测体系中,首先采用比色法实现对样品的快速分析,然后利用SERS技术实现对外泌体表面蛋白的精确定量分析,结合着两种方法实现了对外泌体表面蛋白的快速高灵敏检测。

【技术实现步骤摘要】
一种外泌体表面蛋白检测方法
本专利技术属于外泌体表面蛋白检测领域,具体涉及一种外泌体表面蛋白检测方法。
技术介绍
外泌体是由细胞分泌出的一种尺寸约为30-120nm的囊泡,外层为脂质膜,膜表面表达有特定的蛋白,内部包含了蛋白质、DNA、RNA等生物分子。由于外泌体是由宿主细胞分泌而来,因此外泌体表面蛋白及内容物能反映分泌细胞的生理状态和信息。研究发现,肿瘤细胞的外泌体与肿瘤的发展密切相关,很多肿瘤细胞表面标志物在外泌体表面同样表达,因此通过对外泌体表面蛋白的检测可以一定程度上替代肿瘤细胞的组织活检,这使得外泌体成为一种重要的肿瘤标志物以及治疗靶点。肿瘤外泌体表面蛋白检测是癌症诊断和评估抗癌效果的重要指标之一。外泌体表面蛋白分析检测包括传统的生物学方法,例如通酶联免疫吸附测定(ELISA)、Western印迹、聚合酶链式反应(PCR)等。这些生物学技术在外泌体蛋白分析表征中发挥了非常重要的作用。然而,这些方法通常反应步骤比较复杂且操作繁琐。近来,研究人员提出了一些光电检测技术,包括电化学法、化学发光法、表面等离子激元共振法等。这些方法相对于传统生物检测方法,操作步骤精简,灵敏度提高,但是随着对外泌体检测技术研究的深入,目前的检测方法依旧面临着灵敏度低、程序复杂、成本高等不足。因此,发展一种灵敏度高、准确性好、可操作性强的外泌体表面蛋白检测方法仍是急需解决的问题。比色法的结果可以通过裸眼观察,是一种简单有效的检测手段,缺点是一般检测灵敏度不高。表面增强拉曼散射光谱(SERS)技术作为一种新兴的生物标记手段,一方面继承了拉曼光谱的光谱信息丰富、非侵入性、不易漂白等;另一方面,它弥补了传统拉曼散射信号强度弱、不利于检测的缺点。SERS光谱的“指纹”特性使人们能在复杂的生物环境中跟踪、检测目标分子。此外,SERS效应巨大的增强作用使基于SERS的光谱检测具有超高的灵敏度,甚至可实现单分子水平的分析研究。SERS效应产生在纳米尺度粗糙的金属表面,纳米技术的飞速发展为构建多功能化的SERS纳米探针提供了丰富的技术途径。这些基于SERS光谱技术的纳米探针在生物成像、核酸或蛋白检测等诸多生物医学领域展现出了优异的应用前景。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种外泌体表面蛋白检测方法,通过比色法和SERS光谱技术双信号检测外泌体表面蛋白,一方面通过比色法,能实现外泌体表面蛋白的快速定性检测,另一方面,通过共聚焦拉曼显微系统分析产物中的SERS信号技术对外泌体表面蛋白进行精确的定量分析,解决了现有技术中外泌体表面蛋白间检测操作复杂、灵敏度低、成本高等问题。为解决上述问题,本专利技术采用以下技术方案:一种外泌体表面蛋白检测方法,通过比色法和SERS联合技术检测外泌体表面蛋白,包括如下步骤:步骤一,利用离心法提取肿瘤细胞的外泌体;步骤二,制备报告探针,所述的报告探针为球形金纳米粒子,表面连接拉曼分子;步骤三,在报告探针溶液中依次加入蛋白适配体,待测肿瘤细胞的外泌体,盐溶液,反应后通过比色法观察报告探针的颜色或采用SERS技术检测得到报告探针的SERS信号。作为优选方案,所述步骤一中离心法提取肿瘤细胞的外泌体的步骤包括:收集5mL肿瘤细胞培养基,并于3000rpm离心15min去除细胞或细胞碎片,取出上清液,并在上清中加入1mLExoQuick-TC沉淀液,并于4℃下静置过夜,然后利用1500rpm离心30min,去除上清液,然后将沉淀利用100μLPBS缓冲液重新悬浮,保存待用。作为优选方案,所述步骤二中球形金纳米粒子采用柠檬酸钠还原法制备。作为优选方案,所述报告探针的制备方法,包括如下步骤:步骤一,采用柠檬酸钠还原法制备球形金纳米粒子;步骤二,在步骤一制备的球形金纳米粒子表面连接拉曼分子。作为优选方案,所述柠檬酸钠还原法制备球形金纳米粒子包括:在200mL去离子水中加入200uL质量分数为10%的HAuCl4溶液,剧烈搅拌并加热至沸腾;随后加入8mL质量分数为1%的柠檬酸钠水溶液,继续加热搅拌15min;停止加热,搅拌至溶液冷却至室温,即得到酒红色的球形金纳米粒子溶液。作为优选方案,球形金纳米粒子表面连接拉曼分子包括:取步骤一中的球形金纳米粒子溶液200μL,随后加入4μL10mM的拉曼分子溶液,该混合液继续搅拌2h,随后用蒸馏水8000rpm,30min离心清洗2次,得沉淀并将其分散到200μLPBS缓冲液中,即得到报告探针溶液。作为优选方案,所述拉曼分子为5,5-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB),通过金-硫键以共价的方式连接在球形金纳米粒子表面。作为优选方案,所述蛋白适配体为特异性识别外泌体表面待测蛋白的核酸序列,所述蛋白适配体通过非共价键作用吸附于报告探针表面。作为优选方案,所述PBS缓冲液pH为7.4,浓度为10mM。作为优选方案,所述盐溶液为氯化钠溶液。本专利技术的检测原理:球形金纳米粒子具有典型表面等离子体共振峰,其SERS信号的消光光谱在520nm左右有一明显的消光峰,这一消光峰的存在使得报告探针呈酒红色,也是本专利技术中实现比色法检测的重要基础。报告探针的SERS光谱特征峰分立且规则,有益于定量分析。当蛋白适配体与外泌体表面特定蛋白结合,蛋白适配体不再能保护球形金纳米粒子,球形金纳米粒子发生聚集。而反应体系中外泌体表面没有特定蛋白时,报告探针的消光光谱不会发生变化,球形金纳米粒子不会聚集。消光光谱的差异能通过肉眼直接观察,外泌体表面存在待测蛋白时,溶液呈现紫色,外泌体表面不存在待测蛋白时,溶液呈现为酒红色。当样品中外泌体表面存在特定蛋白时,外泌体表面蛋白与球形金纳米粒子表面的蛋白适配体结合,使蛋白适配体从报告探针表面脱落,观察反应后的报告探针,颜色和SERS信号将区别于与外泌体反应前的报告探针;当样品中外泌体表面没有特定的待测蛋白,球形金纳米粒子表面的蛋白适配体依然吸附于其表面。因此,通过观察报告探针的颜色和检测报告探针的SERS信号,可以实现外泌体表面特定蛋白的检测;即一方面通过比色法,能快速定性地区分外泌体表面蛋白的类型;另一方面,能通过SERS对外泌体表面特定蛋白进行定量分析。与现有技术相比,本专利技术具有的有益效果:1)本专利技术利用具有颜色的球形金纳米粒子作为报告探针,使外泌体表面蛋白检测结果裸眼可观察,利于实现高通量的快速定性检测。2)本专利技术中,报告探针能提供SERS信号,使该方法能实现高灵敏的外泌体表面蛋白的定量检测。3)本专利技术将比色法和SERS技术集成到同一外泌体表面蛋白检测体系中,利用比色法实现对样品的快速定性分析,随后采用SERS技术对样品进行精确的定量检测,两种方法的结合实现了快速高灵敏的外泌体表面蛋白检测。4)本专利技术的外泌体表面蛋白检测方法无需PCR反应,大大简化了检测步骤,同时也提高了检测结果的可靠性。附图说明图1是本专利技术提出的外泌体表面蛋白检测方法示意图。具体实施方式以下通过具体的实施例来进一步说明本专利技术的内容,但应该理解,具体实施例并不以任何方式限制本专利技术的实施范围。如图1所示,本专利技术公开了一种外泌体表面蛋白的检测方法,通过比色法和SERS技术双模信号检测外泌体表面蛋白,包括如下步骤:第一步,利用离心法提取肿瘤细胞的外泌体;第二步,制备报告探针,所述的报告探针为球形金纳米粒子,表面连接拉本文档来自技高网
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【技术保护点】
1.一种外泌体表面蛋白检测方法,通过比色法和SERS联合技术检测外泌体表面蛋白,其特征在于,包括如下步骤:步骤一,利用离心法提取肿瘤细胞的外泌体;步骤二,制备报告探针,所述的报告探针为球形金纳米粒子,表面连接拉曼分子;步骤三,在报告探针溶液中依次加入蛋白适配体,待测肿瘤细胞的外泌体,盐溶液,反应后通过比色法观察报告探针的颜色或采用SERS技术检测得到的所述报告探针的SERS信号。

【技术特征摘要】
1.一种外泌体表面蛋白检测方法,通过比色法和SERS联合技术检测外泌体表面蛋白,其特征在于,包括如下步骤:步骤一,利用离心法提取肿瘤细胞的外泌体;步骤二,制备报告探针,所述的报告探针为球形金纳米粒子,表面连接拉曼分子;步骤三,在报告探针溶液中依次加入蛋白适配体,待测肿瘤细胞的外泌体,盐溶液,反应后通过比色法观察报告探针的颜色或采用SERS技术检测得到的所述报告探针的SERS信号。2.如权利要求1所述的外泌体表面蛋白检测方法,其特征在于,所述步骤一中离心法提取肿瘤细胞的外泌体的步骤包括:收集5mL肿瘤细胞培养基,并于3000rpm离心15min去除细胞或细胞碎片,取出上清液,并在上清液中加入1mL沉淀液,并于4℃下静置过夜,然后利用1500rpm离心30min,去除上清液,然后将沉淀利用100μLPBS缓冲液重新悬浮,保存待用。3.如权利要求1所述的外泌体表面蛋白检测方法,其特征在于,所述步骤二中球形金纳米粒子采用柠檬酸钠还原法制备。4.如权利要求3所述的外泌体表面蛋白检测方法,其特征在于,所述报告探针的制备方法,包括如下步骤:步骤一,采用柠檬酸钠还原法制备球形金纳米粒子;步骤二,在步骤一制备的球形金纳米粒子表面连接拉曼分子。5.如权利要求4所述的外泌体表面蛋白检测方法,其特征在于,所述柠...

【专利技术属性】
技术研发人员:陈辉马佩李钧颖张学典
申请(专利权)人:上海理工大学
类型:发明
国别省市:上海,31

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