稀土掺杂磷酸钙荧光纳米颗粒在生物体内的定量检测方法技术

本发明专利技术涉及一种稀土掺杂磷酸钙荧光纳米颗粒在生物体内的定量检测方法。首先建立稀土离子荧光强度‑浓度标准曲线，然后将待测组样品和空白对照组样品制成匀浆，离心后取上清液测试荧光强度，计算两者单位质量或体积荧光强度值，并进行显著性差异分析；若P≥0.05则判定待测组样品中RE‑nCaP含量为0，若P

【技术实现步骤摘要】
稀土掺杂磷酸钙荧光纳米颗粒在生物体内的定量检测方法
本专利技术涉及生物检测
，具体涉及一种稀土掺杂磷酸钙荧光纳米颗粒在生物体内的定量检测方法。该方法可用于研究荧光纳米颗粒在生物体内的分布与代谢过程。
技术介绍
磷酸钙是人体硬组织(骨头、牙齿等)的主要组成部分，其主要包括无定形磷酸钙(ACP)、二水磷酸氢钙(DCPD)、磷酸八钙(OCP)、羟基磷灰石(HAP)等。磷酸钙具有良好的生物相容性和生物活性，在生物医学领域已得到广泛应用。纳米磷酸钙更是由于较小尺寸、高比表面积、高吸附能力、高生物活性、高成骨能力等优点，在药物载体、生物复合材料无机相、纳米生物陶瓷等方面展现出良好的应用潜力。此外，考虑到稀土元素的荧光性、磁性，稀土掺杂磷酸钙纳米颗粒有望成为一种生物相容、可降解的荧光或磁显影剂，用于疾病的诊断。作为一种生物成像剂，稀土掺杂磷酸钙在生物体组织内的分布及代谢情况是必需研究的内容。目前，可用于磷酸钙纳米颗粒体内示踪研究的技术主要有放射性同位素标记法和高分子荧光物质标记法。放射性同位素标记法具有检测灵敏度高等优点，但是该方法需要在较为严苛的专业条件下进行，并且放射性同位素对生物体有潜在的安全风险。高分子荧光物质标记法一般通过物理吸附或化学键合使高分子荧光物质附着在磷酸钙纳米颗粒的表面，在初期可以起到较好的示踪效果，但是随着磷酸钙纳米颗粒的溶解，高分子荧光物质会与磷酸钙分离而失去标记效果，因而无法起到长期的体内示踪作用。专利技术人团队较早前公开了一种稀土掺杂磷酸钙荧光纳米粒子(RE-nCaP)的制备方法(CN105018086A)以及一种用于细胞内羟基磷灰石(HAP)纳米粒子的定量检测示踪方法(CN103822906A)，该检测示踪方法虽然能够准确的反应羟基磷灰石纳米粒子在细胞内的溶解情况并对其进行定量检测，但是由于没有设置空白对照组进行显著性差异分析，也没有计算稀土元素在生物组织中的提取率，因而准确性有待加强。此外，该检测示踪方法不能准确定量的检测出稀土掺杂磷酸钙在动物组织(包括硬组织、软组织及血液)和代谢物(尿液和粪便)中的含量。在此基础上，专利技术人团队经过不断深入研究，开发了一种新的定量检测方法，该方法的检测极限浓度可达0.1nM，能够精确检测出稀土掺杂磷酸钙纳米颗粒在生物体内(包括硬组织、软组织及血液中)以及生物代谢物中的含量，还可以为纳米颗粒在生物体的分布代谢等研究提供一种精确的检测方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种稀土掺杂磷酸钙荧光纳米颗粒在生物体内的定量检测方法，该方法包括以下步骤：(a)在荧光增强液体系中建立稀土离子RE的荧光强度-浓度标准曲线；(b)利用酸溶液分别处理待测组生物组织样品、不含RE-nCaP的空白对照组生物组织样品，得到待测组匀浆和空白对照组匀浆；取适量待测组匀浆、空白对照组匀浆离心分离得到上清液，用荧光增强液稀释上清液后检测其荧光强度，并对待测组和空白对照组的单位质量或体积荧光强度值进行显著性差异分析。若两者之间不具有显著性差异(P≥0.05)，说明待测组生物组织样品中不含RE-nCaP(即含量为0)，到此结束不再进行后续操作；若两者之间具有显著性差异(P<0.05)，则按照步骤(c)和步骤(d)的操作进一步确定待测组生物组织样品中RE-nCaP的含量。(c)将RE-nCaP分别加入到相同体积的空白对照组匀浆和酸溶液中，离心分离得到上清液，用荧光增强液稀释上清液后检测其荧光强度，根据空白对照组匀浆和酸溶液的荧光强度计算单位重量或体积组织滞留率，进而根据待测组生物组织的重量或者体积计算出待测组组织提取率；(d)综合考虑荧光强度-浓度标准曲线、组织提取率、匀浆体积、单位质量或体积荧光强度值、稀释倍数以及磷酸钙中稀土元素的摩尔含量，最终计算出待测组生物组织样品中RE-nCaP的含量。按照上述方案，步骤(a)中荧光强度y与浓度x标准曲线的建立方法具体如下：以荧光增强液为溶剂，配制一系列不同浓度(7nmol/L以内)的稀土离子标准溶液，利用荧光分光光度计测定稀土离子标准溶液在特定激发波长(330-350nm，优选为340nm)下特定发射波长(如Eu3+为618nm或者Tb3+为488nm)的荧光强度，直线拟合得到荧光强度y与浓度x的关系为：y＝B+Nx。其中，B为截距，单位cps；N为斜率，单位cps/(nmol/L)。按照上述方案，步骤(b)具体过程为：分别精确测量待测组生物组织样品和不含Eu-nCaP的空白对照组生物组织样品的质量或者体积，再加入酸溶液，得到待测组匀浆和空白对照组匀浆；取等量待测组匀浆和空白对照组匀浆，分别离心分离得到上清液，将上清液与酸溶液按照一定比例(体积比1:19)混合后得到上清稀释液，将上清稀释液与荧光增强液按照一定比例(体积比1:199)混合后得到混合液，在特定激发波长下测定特定发射波长的荧光强度。待测组和空白对照组的荧光强度值分别记为y1和y0，按照下述公式计算单位质量或体积组织荧光强度值(T)：其中，T为单位质量或者体积组织荧光强度值(单位，cps/g或者cps/mL)；y为待测组或空白对照组荧光强度值(单位，cps)；W为生物组织样品的重量(固态块体组织，单位g)或体积(液态组织，单位mL)。再对T值进行显著性差异分析。当P≥0.05说明待测组与空白对照组不具有显著性差异，判定待测组中不含RE-nCaP(含量为0)；当P<0.05说明待测组与空白对照组具有显著性差异，继续执行步骤(c)和步骤(d)确定待测组中RE-nCaP的含量。按照上述方案，步骤(c)具体方法如下：将一定浓度的Eu-nCaP水悬浮液(0.25μg/mL)分别与空白对照组匀浆、酸溶液按照一定比例(体积比1.52:1)混合均匀，静置一段时间(4h左右)后离心分离得到上清液，将上清液与酸溶液按照一定比例(体积比1:19)混合后得到上清稀释液，将上清稀释液与荧光增强液按照一定比例(体积比1:199)混合后得到测试液，在特定激发波长下测定特定发射波长的荧光强度。空白对照组匀浆的荧光强度记为A1(单位cps)，酸溶液的荧光强度A0(单位cps)，根据两个荧光强度按照下述公式计算单位质量或者体积组织滞留率S:其中，S为单位质量或者体积组织滞留率，无量纲；W0为空白对照组生物组织重量或者体积(单位g或mL)。由单位质量或者体积组织滞留率S按照下述公式计算待测组组织提取率R：R＝(1-S·W1)×100％，其中，R为组织提取率，无量纲；W1为待测组组织样品的重量或者体积(单位g或mL)。按照上述方案，步骤(d)中按照下述公式计算待测组生物组织样品中RE-nCaP的含量M：其中，M单位nmol/g或者nmol/mL；T1为待测组的单位质量或单位体积组织荧光强度值(单位cps/g或cps/mL)；为空白对照组的单位质量或者单位体积组织荧光强度平均值(单位cps/g或cps/mL)；k为稀释倍数(组织匀浆到测试液的稀释倍数)与磷酸钙中稀土元素摩尔含量的比值；V为待测组匀浆的体积(单位L)。按照上述方案，所述稀土离子具体为Eu3+或Tb3+，稀土离子掺杂方式为单独掺杂，或者与其他稀土元素共掺杂。按照上述方案，RE-nCaP中RE/(RE+Ca)的摩尔比取值范围为0.1％-18％本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种稀土掺杂磷酸钙荧光纳米颗粒在生物体内的定量检测方法，其特征在于，包括以下步骤：(a)在荧光增强液体系中建立稀土离子RE的荧光强度‑浓度标准曲线；(b)利用酸溶液分别处理待测组生物组织样品、不含RE‑nCaP的空白对照组生物组织样品，得到待测组匀浆和空白对照组匀浆；将两组匀浆离心分离得到上清液，上清液用荧光增强液稀释后检测其荧光强度，对待测组和空白对照组的单位质量或体积荧光强度值进行显著性差异分析，从而判定待测组生物组织样品中不含RE‑nCaP，或含有RE‑nCaP并继续步骤(c)和步骤(d)进一步确定其含量；(c)将RE‑nCaP分别加入到相同体积的空白对照组匀浆和酸溶液中，离心分离得到上清液，上清液用荧光增强液稀释后检测其荧光强度，根据空白对照组匀浆和酸溶液的荧光强度计算单位重量或体积组织滞留率，进而根据待测组生物组织的重量或者体积计算出待测组组织提取率；(d)综合考虑荧光强度‑浓度标准曲线、组织提取率、匀浆体积、单位质量或体积荧光强度值、稀释倍数以及磷酸钙中稀土元素掺杂量，最终计算出待测组生物组织样品中RE‑nCaP的具体含量。

【技术特征摘要】
1.一种稀土掺杂磷酸钙荧光纳米颗粒在生物体内的定量检测方法，其特征在于，包括以下步骤：(a)在荧光增强液体系中建立稀土离子RE的荧光强度-浓度标准曲线；(b)利用酸溶液分别处理待测组生物组织样品、不含RE-nCaP的空白对照组生物组织样品，得到待测组匀浆和空白对照组匀浆；将两组匀浆离心分离得到上清液，上清液用荧光增强液稀释后检测其荧光强度，对待测组和空白对照组的单位质量或体积荧光强度值进行显著性差异分析，从而判定待测组生物组织样品中不含RE-nCaP，或含有RE-nCaP并继续步骤(c)和步骤(d)进一步确定其含量；(c)将RE-nCaP分别加入到相同体积的空白对照组匀浆和酸溶液中，离心分离得到上清液，上清液用荧光增强液稀释后检测其荧光强度，根据空白对照组匀浆和酸溶液的荧光强度计算单位重量或体积组织滞留率，进而根据待测组生物组织的重量或者体积计算出待测组组织提取率；(d)综合考虑荧光强度-浓度标准曲线、组织提取率、匀浆体积、单位质量或体积荧光强度值、稀释倍数以及磷酸钙中稀土元素掺杂量，最终计算出待测组生物组织样品中RE-nCaP的具体含量。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(a)中荧光强度y与浓度x标准曲线的建立方法如下：以荧光增强液为溶剂，配制一系列不同浓度的稀土离子标准溶液，利用荧光分光光度计测定稀土离子标准溶液在特定激发波长下特定发射波长的荧光强度，拟合得到直线y＝B+Nx，A和N为常数。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(b)具体过程为：分别精确测量待测组生物组织样品和不含Eu-nCaP的空白对照组生物组织样品的质量或者体积，再加入酸溶液，得到待测组匀浆和空白对照组匀浆；取等量待测组匀浆和空白对照组匀浆，分别离心分离得到上清液，将上清液与酸溶液按照一定比例混合后得到上清稀释液，将上清稀释液与荧光增强液按照一定比例混合后得到混合液，在特定激发波长下测定特定发射波长的荧光强度，按照公式(I)计算单位质量或体积组织荧光强度值T其中，y为待测组或空白对照组荧光强度值，W为待测组或空白对照组生物组织样品的重量或体积；利用计算出的待测组T值和对照组T值进行显著性差异分析，当P≥0.0...

【专利技术属性】
技术研发人员：韩颖超，邢庆国，王欣宇，
申请(专利权)人：武汉理工大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42